肝脏是人体各种物质代谢、能量转换及供应的枢纽和主导器官,是机体内多种重要信息调控分子的“集散地”。与其他器官不同,肝脏具有强大的再生能力。创伤和各种肝病后,残存肝组织很快会进入复杂的再生过程。肝再生一直是哺乳动物肝脏研究中的一个重要焦点。研究肝再生分子机理必将对肝脏移植、创伤、各种肝病及肝肿瘤诊治具有重要意义。因为肝细胞再生的机制非常复杂,影响因素众多,尽管对肝再生进行了大量分子生物学研究,发现包括激素、生长因子和细胞因子,以及相关基因参与了这个复杂过程,但是对肝再生的分子机理,尤其是肝再生终止和重塑阶段的机制仍不清楚。肝再生以往的研究,通常采用的是传统的分子生物学方法对某些因子的时空表达差异、信号传导通路、调控机制等作详细研究,这使得肝再生的研究只局限于某些因子或某条信号通路,缺乏对复杂的肝再生过程从启动到增殖再到终止的全面多角度分析。蛋白质是生命活动的执行者,物质的代谢活动离不开蛋白质的参与,蛋白质组学(proteomics)是以细胞内全部蛋白质的存在及其活动方式为研究对象,分析机体内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,在整体水平上研究蛋白质的组成与调控的活动规律。由于其研究的是生命活动的直接体现者和执行者—蛋白质,因此更接近生理或病理的本质。差异蛋白质组是蛋白质组学研究的一个主要内容,其核心在于寻找某种特定因素引起样本之间蛋白质组的差异,揭示并验证蛋白质组在生理或病理过程中的变化。Gene→Pr→Metabolite一切生命活动依赖于物质代谢,如细胞信号合成和释放、细胞间信号通信、能量传递和细胞增殖分化等。代谢组学(metabonomics)可以揭示生命代谢活动全貌和规律,因此代谢组学是“组学”研究的最终方向。代谢组学具备以下优势:基因和蛋白表达的微小变化会在代谢物水平得到放大;高通量,单个样品的检测时间5-10秒;所得到的信息量巨大;反映代谢事件的最终结果。针对这一现状,可以利用具备高通量特点的组学研究手段来解决这一问题。利用蛋白质组学及代谢组学两种高通量研究手段分别从蛋白质水平及代谢物水平对肝再生进行全面分析:通过差异蛋白质组学技术寻找和筛选肝再生过程中差异蛋白的表达谱及表达变化规律;通过代谢组学技术对肝再生过程不同阶段的小分子代谢物进行质谱鉴定,以获得一些相关的生物标志物,得到肝再生的代谢图谱及代谢变化规律。通过对差异蛋白与代谢物的结合分析、相互验证,从整体角度把握肝再生各个阶段变化规律,从而有助于阐明肝脏再生的分子机制。第一部分大鼠肝再生过程中蛋白质组学的研究本部分研究中我们建立了经典的大鼠肝再生模型,SD大鼠随机分为70%肝部分切除组(PH组)和假手术对照组(Sham-operated,SH组),实验分组:每一种动物实验模型再按手术后观察时间分手术后3h、12h、、3d、7d、11d和14d六个组。以便观察包括肝再生终止阶段的全过程,每组10只动物。PH组大鼠在无菌条件下切除肝左叶和中叶(约为全肝的70%);SH组大鼠同样开腹,但不切肝。70% PHx后,处死大鼠,迅速取右叶肝组织,分别在不同时间点和假手术模型的肝组织中提取胞浆蛋白,以SH组为对照,进行双向凝胶电泳分离蛋白,PDQuest7.4软件对双向电泳图谱进行分析,找出与肝再生相关的差异蛋白,共筛选到差异蛋白点556个。对肝再生术后12 h (早期),7d、11d(后期)的差异蛋白进行了质谱鉴定,生物信息学分析。同时,对部分差异蛋白11d(后期)进行了蛋白水平验证。通过PDQuest 7.4软件图像分析比对,以两倍差异为阈值共送检差异蛋白点15个。质谱(MALDI-TOF/TOF MS)技术成功鉴定出其中13个差异蛋白。经生物信息学分析这些差异蛋白参与了多条代谢途径,如糖代谢,脂代谢,氨基酸代谢,抗氧化,呼吸链和氧化磷酸化,生物转化以及信号转导等。这些结果表明70%PHx后,肝细胞通过多条代谢途径对肝再生进行调节,值得关注的是肝再生后期(11d)两种抗氧化蛋白过氧化物酶1(peroxiredoxin 1)和过氧化物酶6(peroxiredoxin 6)的表达量截然相反,分别与SH组比较,前者的表达升高两倍以上而后者则降低两倍以上,推测这两个蛋白在肝再生后期终止重塑阶段除了扮演抗氧化的角色,还参与了其它再生功能的调控。第二部分大鼠肝再生过程中代谢组学的研究代谢是生命活动中所有(生物)化学变化的总称。代谢活动是生命活动的本质特征和物质基础。代谢组是生物体内源性代谢物质的动态整体。代谢组学是关于生物体内源性代谢物质的整体及其变化规律的科学。代谢组学是以物理学基本原理为基础的分析化学,以数学计算与建模为基础的化学计量学和以生物化学为基础的生命科学等学科交叉的学科。细胞内的生命活动大多发生于代谢层面,故代谢组学被认为是“组学”研究的最终方向。本课题将上述大鼠肝再生PH组、SH组九个时间点的肝组织及血液分别进行蛋白沉淀的样品处理,通过Agilent LC/Q-TOF-MS完成数据采集。利用主成分分析法(PCA),偏最小二乘法回归(PLS)进行数据分析。在九个时间点间和与假手术组间比对中找出相关的生物标志物,即biomarker的鉴定,以获得肝再生全过程的biomarker图谱及其动态变化规律。本实验中Biomarker所涉及的代谢途径包括糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢和核酸代谢等。蛋白质组学与代谢组学为定量生理或病理状态下蛋白质及代谢物的变化,提供了一个理想的平台。然而,在肝脏的研究中,蛋白质组学与代谢组学相结合的技术仍然处于起步阶段。到目前为止,尚没有任何有关两组学技术结合研究肝再生的报道。目前我们的研究是以往针对单一信号通路的研究所不可比拟的。两种高通量实验技术为我们提供了一个崭新的思路,使我们最终得到大量的实验数据。经过分析我们发现肝再生早期能量需求增加,糖代谢加强,其中D-苏力糖醇水平升高,且蛋白烯醇酶-1表达量上调。肝再生过程中,肝脏内生物膜的代谢经历了由快到慢的转变,因为磷脂作为各种生物膜的重要组成部分,其代谢在再生早期增强而在后期减弱,表现为再生早期植物鞘鞍醇和溶血磷脂酰胆碱(18:2(9Z,12Z))水平升高;再生后期溶血磷脂酰胆碱(16:0)、(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))水平降低。具有磷脂酶A2催化活性的过氧化物酶-6经蛋白组学分析及Western-blot验证,在70% PHx后的11d表达下调。然而,如何能够更加全面地解释这些组学数据成为了一项巨大的挑战,有待进一步研究探索。主要结论:1.首次应用蛋白质组学与代谢组学技术相结合的方法,对肝脏再生全过程进行高通量的筛选分析及相互验证,为研究肝脏在其它疾病中的作用提供了一个很好的思路和技术路线;2.大鼠肝再生中胞质蛋白二维电泳显示碱性端密集现象,差异蛋白在肝再生早期最多,这可能与此时细胞增殖旺盛相关;3.肝脏再生全过程中筛选到差异蛋白点556个,其中最显著差异蛋白点15个,质谱鉴定出13个,涉及了糖代谢,脂代谢,氨基酸代谢,抗氧化,氧化磷酸化,生物转化以及信号转导等;4. Western-blot验证了蛋白Prx1和Prx6,推测该蛋白在肝再生终止及结构重塑阶段可能发挥了重要作用;5.大鼠肝再生组织和血清样品中分别筛选到差异代谢物71和59个,涉及糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢和核酸代谢,主要特点表现为肝再生过程中脂代谢变化显著,其中磷脂的代谢早期增强,后期减弱,生物转化功能表现为前弱后强。这些变化与肝脏再生早期增殖分裂增强,膜周转加快,以及后期再生终止,肝功能成熟是一致的;6.肝再生早期代谢物D-苏力糖醇、顺式乌头酸水平升高并且烯醇酶-1表达量上调,说明肝再生早期能量需求增加,糖代谢旺盛,而在再生后期乳酸含量降低,说明糖代谢特别是无氧代谢有所减弱。