microRNA (miRNA)是在多种真核生物和病毒中表达的长度为19-25个核苷酸(Nucleotide, nt)的非编码单链小分子RNA,在物种之间具有高度保守性,通过与靶基因mRNA进行完全或不完全互补配对,以促进mRNA降解(植物中较常见)和抑制蛋白翻译(哺乳动物中较常见)两种经典作用方式在转录和转录后水平广泛调控基因的表达,参与一系列生物学过程的调控。最近,在人以及模式动物上的大量研究结果显示,许多miRNA分子可以参与脂肪代谢和脂肪细胞分化过程,发挥着正向或负向调控作用,已逐渐显现出降脂抗肥胖的临床应用前景。然而,遗憾的是,到目前为止,由于缺少合适的核酸药物传递系统,对miRNA的研究大多数还只是停留在基础理论水平,在生物医学和农业生产上的应用性研究还极其欠缺。因此,安全、稳定、高效、特异性强的运载工具是核酸药物成功应用于临床和生产实践的关键技术。近年来,细胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)作为一种新的核酸药物传递系统成为生物医药领域研究的热点。迄今,miRNA调控脂肪代谢的研究主要在人或啮齿类模式动物上进行,猪上的研究相对欠缺。因此,本研究通过体内和体外两个脂肪沉积发生变化的模型,筛选出在猪脂肪代谢过程中起重要作用的miRNA分子并进行功能验证；并将对其中的一个miRNA (miRNA-130b)进行体外：microvesicle (MV)(EVs的一种)包裹,并通过体外和体内试验深入研究MV包裹的miRNA-130b的降脂功能,为miRNA在生物医学和农业生产上的应用提供重要的实验依据。1采用在体试验模型筛选选调控猪脂肪代谢的关键miRNA分子以往的研究发现,母体妊娠期和哺乳期低蛋白日粮可程序化地影响子代脂质沉积。因此,本实验选用14头体重在36.1±1.8 kg范围内的初产小梅山母猪,随机分为标准蛋白组(SP)和低蛋白组(LP)。在妊娠和哺乳期,SP组母猪分别饲喂粗蛋白含量为12%和14%的日粮,而LP组母猪分别饲喂粗蛋白含量为6%和7%的日粮。在正常分娩后24 h内,SP和LP组每窝调整为7-8只仔猪进行后续试验,子代35 d断奶屠宰。记录仔猪体重和背膘厚,检测血清中甘油三酯和游离脂肪酸水平,采用荧光定量PCR (Real time PCR, RT-PCR)及Western blot方法检测仔猪脂肪组织中过氧化物增殖物激活受体Y(Peroxisome proliferators-activated receptor gamma, PPAR-y)和CCAAT增强子结合蛋白p (CCAAT enhancer binding protein beta, C/EBP-β)基因表达,并利用生物信息学方法预测了靶向PPAR-y和C/EBP-p mRNA 3’-UTR的miRNAs并分析其在物种间的保守性,采用RT-PCR方法检测脂肪组织中]niRNAs的表达丰度。结果显示,虽然血清中甘油三酯含量在两组之间无显著变化,但是LP组的体重、背膘厚及背膘指数均显著低于SP组(P<0.05),血清中游离脂肪酸含量在LP组也有下降的趋势(P=0.083),揭示母体低蛋白影响了后代断奶仔猪背脂中的脂肪沉积。尽管脂肪细胞分化过程中两个重要功能基因PPAR-y和C/EBP-β的mRNA表达在两组间无显著差异,但PPAR-y蛋白表达在LP组显著下降(P<0.05),C/EBP-β蛋白表达也呈下降趋势(P=0.056),提示了转录后调控机制的存在。靶向PPAR-y 3’-UTR的miRNA-130b和靶向C/EBP-β3’-UTR的miRNA-374b;表达在LP组均显著升高(P<0.05),且miRNA-130b和miRNA-374b的“种子序列”与各自靶基因3’-UTR上的结合位点在物种间具有较高的保守性。以上结果表明,利用母体低蛋白日粮引起后代断奶仔猪脂肪沉积下降为在体动物模型,筛选出在猪脂肪细胞分化过程中起重要调控作用的miRNA-130b和miRNA-374b,并提出miRNA-130b和miRNA-374b可能分别通过抑制PPAR-y和C/EBP-β蛋白表达从而降低脂肪沉积。2采用离体试验模型筛选调控猪脂肪代谢的关键miRNA分子以往的研究发现,糖皮质激素(Glucocorticoids, GCs)可以促进脂肪沉积,因此,本试验利用GCs处理猪原代脂肪细胞,构建体外模型并筛选调控猪脂肪细胞分化和脂肪沉积的miRNAs.断奶梅山仔猪皮下脂肪分离血管基质细胞,增殖培养至80%融合时以10-6M地塞米松处理48 h,同时设空白对照组；10-6M糖皮质激素受体(Glucocorticoid receptor, GR)拮抗剂RU486组；10-7M地塞米松+10-6RU486组。MTT方法检测10-6M地塞米松对细胞活力的影响,油红O染色方法检测甘油三酯含量。运用RT-PCR方法检测脂肪细胞分化过程相关基因mRNA表达,Western blot方法检测PPAR-γ和C/EBP-β蛋白表达,RT-PCR方法检测靶向PPAR-y和C/EBP-p mRNA 3’-UTR的miRNAs勺丰度。结果显示：10-6M地塞米松显著增加脂肪细胞中甘油三酯含量(P<0.05),而细胞活力在4组间无显著差异(P>0.05)；地塞米松显著上调了Perilipin和PPAR-γ表达(P<0.05),而C/EBP-β表达显著下降(P<0.05)。靶向C/EBP-p的miRNA-374a/b表达在地塞米松处理组显著升高(P<0.05),与此同时,靶向PPAR-y的miRNA-128和miRNA-130b表达也显著升高(P<0.05)。以上结果表明,利用GCs处理下的猪原代脂肪细胞作为离体模型,我们成功筛选出调控猪脂肪细胞分化和脂肪沉积的miRNA-128, miRNA-130b和miRNA-374a/b。3双荧光素酶报告基因系统验证miRNA-130b和miRNA-374b的功能在本部分试验中,我们构建了双荧光素酶报告基因系统进一步验证IniRNA-130b和miRNA-374b在调节靶基因中的作用。以猪基因组DNA为模板,运用带有Xbal酶切位点的特异性引物扩增PPAR-y和C/EBP-p mRNA 3’-UTR,然后插入到pGL3-Control萤火虫荧光素酶质粒的Xbal酶切位点处。其次,将人工合成的miRNA前体引物序列或阴性对照(Scrambled control, SC)经退火形成的双链前体连接到pSilencer 3.0-H1 siRNA线性化表达质粒上,最后,将构建好的靶基因3’-UTR-pGL3萤火虫荧光素酶质粒、pRL-TK海肾荧光素酶质粒和miRNA过表达质粒或阴性对照质粒(miRNA-SC)共转染人的宫颈癌细胞系Hela-229细胞,共转染24 h和48 h后,利用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光值。结果显示,在Hela-229细胞中,过表达miRNA-130b 24 h和48 h能够显著抑制带有PPAR-y 3’-UTR的双荧光素酶报告基因的活性(P<0.05),同时,过表达miRNA-374b 24 h和48 h后也能够显著抑制带有C/EBP-p 3’-UTR的双荧光素酶报告基因的活性(P<0.05)。双荧光素酶的活性测定结果表明了miRNA-130b能够直接识别并结合到PPAR-y的3’-UTR,从而抑制了PPAR-y的基因表达。此外,miRNA-374b能够直接识别并结合到C/EBP-β3’-UTR从而抑制C/EBP-β表达。4 MV包裹的miRNA-130b的制备及其在离体模型上的功能研究在前面的研究中,我们发现了miRNA-130b可以通过抑制其靶基因PPAR-y的表达进而减少脂肪沉积。本部分研究中,我们利用质粒转染的形式使Hela-229细胞高表达miRNA-130b,并探讨在高表达情况下miRNA-130b能否被MV成功包裹并借助于MV进入受体细胞中,并在受体细胞中发挥如内源性miRNA-130b一样的生物学功能,即通过抑制靶基因PPAR-y表达负向调控脂肪的沉积。结果显示,高表达miRNA-130b的Hela-229细胞能够成功包裹miRNA-130b进入MV,并主动分泌这种富含miRNA-130b的MV(miRNA-130b-MV)进入细胞上清中。我们进一步发现,与转染阴性对照质粒miRNA-SC的对照组MV (miRNA-SC-MV)相比,富集miRNA-130b的MV分子中含有较高浓度的Argonaute蛋白2和热休克蛋白90 α,而以往的研究证明这两种蛋白质可以保护循环系统中miRNA免被RNA酶降解。我们进一步使用提纯的富含miRNA-130b的MV蛋白处理猪原代脂肪细胞,结果显示miRNA-130b-MV处理48 h和96 h后,受体细胞增殖能力未发生改变；甘油三酯沉积显著下降(P<0.05)；miRNA-130b-MV处理48 h后,受体细胞内miRNA-130b表达显著上升(P<0.05)；靶基因PPAR-y的表达显著抑制(P<0.05)；PPAR-y下游的脂肪细胞分化和脂肪组织合成相关基因的表达发生明显改变,脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase, FAS)、围脂滴蛋白(Perilipin)、脂肪和肥胖相关基因(Fat mass and obesity-associated gene,FTO)和GRmRNA表达均显著下陬P<0.05),激素敏感脂西(Hormone sensitive lipase, HSL) mRNA表达显著上升(P<0.05)。以上结果揭示在miRNA-130b高表达的情况下,Hela-229细胞可以成功包裹miRNA-130b进入MV。此外,我们还发现,MV包裹的miRNA-130b可以作用于猪原代脂肪细胞并通过抑制受体细胞中靶基因PPAR-γ的表达,进而抑制脂肪细胞分化和脂肪组织生成,减少脂肪沉积。5 MV包裹的miRNA-130b在在体模型上的功能研究为了进一步探讨MV包裹的miRNA-130b能否在在体模型上减少动物的脂肪沉积,本试验选用SPF级C57BL/6N小鼠作为动物模型,随机分为两组：正常对照组饲喂正常脂肪日粮(MD 100%,n=12)；肥胖诱导组饲喂高脂日粮(MD 45%n=36)。正式饲喂8周后,称量体重并检测葡萄糖耐受情况。确认肥胖模型诱导成功后,将肥胖小鼠随机均分为2组：实验组尾静脉注射miR-130b-MV (HF-130b-MV);对照组尾静脉注射miR-SC-MV (HF-SC-MV);每两天注射一次,每次200“L(约200 μg MV全蛋白),注射10天后采样,注射过程中日粮不更换。结果发现,高脂日粮正式饲喂8周后,小鼠体重极显著升高(P<0.001),并发生葡萄糖抵抗(P<0.01)。与HF-SC-MV组相比,miR-130b-MV注射10天后,HF-130b-MV组小鼠葡萄糖抵抗情况明显减轻；小鼠的体重以及附睾脂肪和腓肠肌含量均显著降低(P<0.05)；肝脏重无明显变化：附睾脂肪重／体重有下降的趋势(P=0.063)；肝脏重／体重上升(P<0.05)；腓肠肌重／体重无明显改变。以上结果揭示miR-130b-MV在在体模型上也具有一定的减少脂肪沉积功能,然而,其具体的分子机制还有待于进一步探讨。