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杜氏盐藻(Dunaliella sallina)是无细胞壁的真核绿藻,可以在极端环境下大量积累类胡萝卜素。解析参与胡萝卜素合成基因的功能有助于具突破性状盐藻优异种质的定向培育和建立富集特定天然产物的工程株系,以期为高值盐藻产品的商业化生产提供科学依据。为此,本研究以杜氏盐藻Ds-YC011藻株为试材,以杜氏盐藻类胡萝卜素合成途径中的关键酶基因DsLYCB和DsLYCE为靶标,克隆这两个关键基因的编码序列和构建表达载体。通过农杆菌介导烟草瞬时表达和应用电击转化法将靶基因导入杜氏盐藻细胞并使其有效表达,鉴定这两个酶基因的生物学功能,进而培育高产类胡萝卜素的优异盐藻株系。主要研究结果如下:1.从运城盐湖水样中分离并纯化获得试验用盐藻藻株,细胞形态学和18S rDNA分子鉴定其为杜氏盐藻的一个新株系(Ds-YC011)。2.针对表达载体携带抗潮霉素筛选标记基因,通过检测杜氏盐藻细胞对不同潮霉素的敏感性,确定固体和液体培养筛选阳性转化体的潮霉素浓度分别为200μg/mL和800μg/mL。3.利用高保真RT-PCR的方法成功分离获得盐藻DsLYCB和DsLYCE基因编码序列。生物信息学分析显示,DsLYCB为不稳定亲水性蛋白,无跨膜结构。二级结构中α-螺旋结构最多,占39.9%。DsLYCE为不稳定亲水性蛋白,有跨膜结构。二级结构中无规则卷曲结构最多,占43.27%。同源比对和系统进化分析表明,杜氏盐藻DsLYCB、DsLYCE蛋白与雨生红球藻的相似性最高。4.高盐胁迫显著上调杜氏盐藻DsLYCB和DsLYCE基因的表达量,在胁迫4 h时表达量最高,且类胡萝卜素含量亦达峰值。DsLYCB和DsLYCE基因表达水平与类胡萝卜素富集呈正相关。5.为探讨DsLYCB和DsLYCE在高等植物中是否调控类胡萝卜素的合成,本研究构建了这两个基因植物表达载体pCAMBIA1303+DsLYCB和pCAMBIA1303+DsLYCE,并采用农杆菌介导使这两个基因分别在烟草叶片组织中瞬时表达。转烟草叶片生化分析显示,目的基因瞬时表达烟草叶片的类胡萝卜素含量比野生型增加24%,其中β-胡萝卜素增加42.3%。此外,转基因叶片的叶绿素a和叶绿素b含量也显著高于野生型烟草及转空载烟草叶片的含量(P<0.05)。这表明杜氏盐藻DsLYCB和DsLYCE基因在高等植物中能正常行使功能,促进类胡萝卜素的合成与积累。6.建立了基于电击转化法的杜氏盐藻遗传转化体系,将DsLYCB和DsLYCE分别成功导入杜氏盐藻细胞,并获得目的基因有效表达。7.对盐藻生物量以及类胡萝卜素含量检测表明,转基因盐藻细胞生长情况与野生型基本一致。转基因盐藻细胞类胡萝卜素总量和β-胡萝卜素的积累量显著高于野生型的含量(P<0.05)。总之,本研究分离获得具有催化功能的杜氏盐藻DsLYCB和DsLYCE基因,并建立了基于电击转化的杜氏盐藻遗传转化体系。这为未来建立高效的盐藻遗传转化体系奠定了基础,也为建立杜氏盐藻高产类胡萝卜素等高附加值产物的调控策略和应用提供了理论依据和技术支撑。