一、研究背景骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCS)自20世纪中期被发现以来,一直备受科学界的关注。BMMSCS来源于中胚层,是一类具有自我复制和多向分化潜能的非造血干细胞,主要存在于全身结缔组织和器官间质中,在骨髓中的含量最为丰富。近年来,随着大家对骨髓间充质干细胞研究和认识的加深以及细胞生物工程技术的不断发展,骨髓间充质干细胞在临床医学和再生医学中应用越来越广泛,是当前组织修复领域的研究热点。BMMSCS在体外分离培养方法简单,扩增速度比较快,并且在一定条件下可以诱导分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等,BMMSCS的临床应用大部分都是基于它的多向分化潜能,但是BMMSCS的体外诱导分化条件不成熟,诱导效率不稳定,有待进一步的研究。骨质疏松(osteoporosis,OP)是以低骨量和骨组织微结构破坏为特征,导致骨质脆性增加并且容易引起骨折的一种全身性代谢性疾病。尤其在绝经后妇女常见,绝经后雌激素分泌明显降低,骨质吸收和骨质形成均加快,呈高转换型骨代谢,骨质吸收的过程相比较成骨的过程短,从而造成骨量的丢失。成骨细胞、破骨细胞及骨髓间充质干细胞在骨质疏松的发生机制中占有很重要的地位。近年来所研究的具有抗骨质疏松作用中药活性成分多是促进成骨细胞的增殖或者抑制破骨细胞的生成而发挥功效,而所属药物成分对骨髓间充质细胞的作用常常被忽略。目前,关于中药成分作用于骨髓间充质干细胞从而促进成骨能力防治骨质疏松鲜有报道,相关机制的研究更不明确。佛手柑内酯(Bergapten, BP)为呋喃香豆素天然产物,是多种植物的次级代谢物,广泛的存在于自然界中,更是佛手、当归、香橼和羌活等众多中药材中的有效成分之一。BP在国外运用于白癜风等皮肤病的临床治疗已经有几十年的历史,并且取得不错的疗效。近年来BP在肿瘤方面作用的研究成为热点,有研究发现,其对胃癌、肝癌、乳腺癌及鼻咽癌细胞具有体外抑制作用,并且对相关的机制进行了研究,取得了不错的进展。同时,BP的其他功效也进行了广泛的研究,有研究发现,BP可以通过抑制破骨细胞及其前体细胞的形成从而阻止脂多糖导致的骨质流失和吸收。BP也可以通过增高骨形成蛋白2(BMP-2)的表达加强骨生成。由此可见,BP确实具有促进骨质形成及抑制骨质吸收的功能。但是BP在骨髓间充质干细胞成骨方面的作用及防治骨质疏松的动物实验未见报道。Wnt信号通路包括3条细胞内信号转导通路,即Wnt/β-catenin信号转导通路、Wnt/Ca2+信号转导通路和Wnt/平面细胞极性(PCP)信号转导通路。Wnt/β-catenin信号通路参与调控胚胎的正常发育和细胞增殖、迁移与分化等重要生理过程,在骨量和骨生长调控的重要作用得到证实,是目前骨骼系统相关疾病发病机制及骨代谢研究的热点。BMMSCS的分化方向受多种因素,多个信号途径的调节,Wnt/β-catenin信号通路同归旁分泌或者自分泌的方式影响细胞的分化和增殖。正常状态下,大部分胞质内的β-catenin被束缚在由细胞膜向胞内伸出的E-钙粘着蛋白上,而其余部分与大肠腺瘤样蛋白和轴素多聚蛋白复合物结合,有利于胞浆内糖原合成酶激酶(GSK-3β)磷酸化和上述复合物结合的β-catenin,被磷酸化的β-catenin易被泛素-蛋白酶体系统降解,从而保持细胞质内游离的β-catenin浓度处于相对较低的状态,在Wnt信号通路活化时,通过拮抗对β-catenin的磷酸化、降解作用,使胞质内β-catenin含量积聚并且移至核内,与核内转录因子TCF/LEF家族相连接,从而控制下游靶基因的调控长骨远端生转录和表达。因此,在一定程度上讲,BP通过调控Wnt信号通路从而参与到调控BMMSCS向成骨细胞分化的过程中来的。β-catenin作为Wnt信号通路的下游蛋白,是Wnt行使生理功能的重要信号分子,在实际的研究过程中,人们往往通过检测β-catenin的表达量来衡量Wnt信号通路的活性,因此,不难看出β-catenin是Wnt通路中非常重要的蛋白因子。二、目的1.探索不同浓度BP对BMMSCS增殖活性的影响,筛选适合BMMSCS分化增殖的药物浓度。2.研究体外条件下不同浓度BP对BMMSCS分化增殖能力的影响,分析BP促进BMMSCS向成骨细胞分化的分子机制。3.在骨质疏松的动物模型上通过对骨质疏松症的治疗,验证BP在活体内促进BMMSCS转化为成骨细的有效机制三、材料和方法1、BMMSCS分离培养及BP浓度对其增殖的影响选取4周大的雌性C57BL/6小鼠4只,断颈法处死后消毒双下肢手术部位,用无菌眼科剪依次剪开皮肤、肌肉,无菌取出双侧胫骨和股骨,并放入磷酸缓冲盐溶液(PBS)中清洗。剪掉胫骨和股骨的两端,暴露骨髓腔,用注射器反复吸取培养基冲洗胫骨和股骨中的骨髓,反复吹打均匀分散后用离心管800r/min离心4min,细胞沉淀加入10%胎牛血清和1%双抗(青、链霉素)的DMEM/F12完全培养基中,接种在25cm2培养瓶中,密度为1x106/ml,放入培养箱中孵育。48小时后除去未贴壁的细胞,更换新的培养液。每三天换一次培养液,待细胞融合至90%以上时进行消化传代。选取第四代BMMSCS,种入96孔板,往完全培养基中加入BP(溶解于DMSO),设置不同浓度组(浓度为分别为0.1μM/L,1μM/L,10μM/L,100μM/L),对照组加入相同体积的二甲基亚砜(DMSO)每组设10个孔,培养14天后,每孔加入10μLCCK8试剂,将培养板放入培养箱中继续培养2h,酶标仪450nm波长读板,获取吸光度值(OD值),了解不同浓度BP对BMMSCS增殖的影响。2、BP对BMMSCS体外诱导分化成成骨细胞的影响取第4代BMMSCS种入六孔板内,每孔细胞数为1x105,加入2ml成骨诱导培养基(完全培养基加β-磷酸甘油10mMol/L,抗坏血酸50μMol/L,地塞米松0.1μMol/L),隔三天换一次液。每组加入的培养基和其体积均是一样的。实验组加入不同浓度BP,即0.1,1,10μM/L,对照组加入相同体积DMSO,每组11个孔。在细胞培养箱培养14天后,用试剂盒测量裂解细胞的吸光度从而测量细胞内的碱性磷酸酶(ALP)活性。部分细胞用4%多聚甲醛固定后,用BCIP/NBT ALP显色剂染色。用免疫蛋白印迹技术(WB)检测RUNX2和OCN在细胞内的表达,用多种方式多个指标观察BP对BMMSCS成骨分化的影响,在机制方面,本研究选择了β-catenin和GSK-3p的蛋白免疫印迹来验证BMMSCS中Wnt通路的状况,从信号通路上揭示BP促进BMMSCS成骨的机制。3、BP在体内促进成骨的研究36只雌性C57BL/6小鼠平均分为三组,每组12只：实验组(OVX+BP组,手术切除双侧卵巢加用BP)、对照组(OVX组,仅双侧切除卵巢)、阴性对照组(Sham组,仅做模拟手术,不切除卵巢)。实验组小鼠每天以20mg/kg/d进行灌胃饲养,对照组和阴性对照组用同样体积的生理盐水进行灌胃。两个月后,从三组小鼠中各取3只的股骨标本做显微CT(Micro-CT,μCT)扫描和三维重建,扫描部位为股骨上段。显微CT扫描设置的参数为：扫描电压70 KV,功率为30 W,扫描电流为429μA,每次扫描厚度为20 μm。另从各组取3只小鼠股骨标本,并且对股骨上段进行HE染色小鼠股骨上段骨显微结构的影响,观察骨小梁的数目,骨皮质厚度等。取各组剩余6只小鼠的股骨标本,并且对股骨上段进行OCN和RUNX2的免疫组织化学染色(3只进行OCN免疫组织化学染色,3只进行RUNX2的免疫组织化学染色)。4、统计学方法实验数据采用SPSS21.0统计软件进行统计学分析。计量资料结果以均数±标准差表示,多组间数据比较采用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD检验,检验水平αμ=0.05,P<0.05认为差异有统计学意义。四、结果1、BP浓度对BMMSCS增殖能力的影响在将BP作用于BMMSCS观察对成骨能力的影响前,我们需要一个合适的浓度,对细胞没有毒性作用。运用CCK8法检测各浓度BP处理的BMMSCS的吸光度值。结果显示：0,0-1,1,10μμM/L四组的吸光度值没有统计学差异,表明这三个浓度的BP对细胞活性没有影响,而100μμM/L的吸光度值明显降低,说明了该浓度BP明显抑制了细胞增殖。2、BP在体外对BMMSCS成骨分化的影响。本研究通过ALP活性检测及染色发现,在成骨诱导培养基中加入BP后促进了BMMSCS中ALP的活性,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),并且随着浓度的增高,ALP的表达也会随之升高,各浓度组之间同样具有统计学差异(P<0.05)。从OCN和RUNX2的蛋白免疫印迹和利用OSX(Osterix,成骨相关转录因子)的免疫荧光染色观察可以看出,BP在成骨诱导培养基中同样可以促进BMMSCS中OCN、RUNX2和OSX的表达,与对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05),随着浓度的升高,表达量也会增加,各浓度组差异同样具有统计学意义(P<0.05)。通过对机制的研究,在BMMSCS中,加入BP的实验组P-catenin和GSK-3β的表达同样增强,且随着浓度升高表达增强(P<0.05)。3、BP在骨质疏松模型内促进成骨的研究结果首先,我们在小鼠H&E染色中发现,和阴性对照组相比,位于对照组与实验组小鼠的股骨上段的骨小梁排列稀疏,骨小梁和骨皮质的厚度变薄,但是实验组的骨小梁和骨皮质情况较对照组组明显好转。另外,通过对小鼠的股骨进行Micro-CT扫描及RUNX2免疫组织化学染色和OCN的免疫荧光染色发现,可以发现相似的结果,即手术后的小鼠可以发现明显的骨质疏松情况,阴性对照组的骨小梁数目、OCN和RUNX2的表达较实验组和对照组的均要高,差异具有统计学意义(P<0.05)而骨小梁分离度较低,差异具有统计学意义(P<0.05)。但是BP处理之后的小鼠骨质疏松情况较对照组的骨小梁数量增多,OCN和RUNX2表达增高,骨小梁分离度降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。五、结论1.100μM/L的BP对BMMSCS的增殖具有明显的抑制作用,而0.1,1,10μM/L的BP不影响细胞活性,对细胞没有毒性。2.BP可以促进BMMSCS向成骨细胞的分化,ALP,OCN,RUNX2,DSX等成骨分化相关的指标的表达增高,且与浓度相关,随着浓度提高而升高。这个过程的形成机制是通过激活成骨信号通路Wnt通路实现。3.BP能有效促进骨质疏松动物模型中的成骨形成,间接表明BP在活体内可以促进BMMSCS向成骨细胞分化。