研究背景和目的肿瘤蛋白质组学技术,作为本世纪肿瘤学研究领域的新技术,在发现与肿瘤发生发展相关基因及阐明相关基因参与的信号通路、明确其影响肿瘤进展的分子机制等方面有重要作用。蛋白质组学可以实现对整条分子信号通路的逐点筛选,可为肿瘤治疗提供潜在的分子靶标。结直肠癌作为我国常见及高发肿瘤之一,其发病率逐年攀升,死亡率居高不下,通过肿瘤比较蛋白质组学相关技术筛选并发现影响结直肠癌转移的相关基因,并应用分子生物学方法研究其下游分子信号通路进而查找潜在的治疗可攻分子靶点、控制肿瘤转移,对改善患者预后,提高生存期限具有重要意义。WTX,全称 Wilms Tumor gene on the X chromosome,又名 FAM123B,是首个被发现定位于X染色体上的抑癌基因,其在生物体多项正常生理功能,如调控间叶组织分化中发挥重要作用;并被报道与Wilms Tumor等多种肿瘤发生、发展相关。有趣的是,WTX基因序列中包含3个腺瘤样结肠息肉病(adenomatous polyposis coli,APC)结合区域,可与APC直接结合并调控其表达水平及细胞内定位分布;且本课题组在研究前期曾在全身多种器官肿瘤及配对正常组织中广泛检测了 WTX表达水平,结果显示:与正常结直肠黏膜上皮相比,WTX在结直肠癌组织中的表达明显降低。提示WTX基因表达缺失,可能在结直肠癌的发生、发展过程中发挥作用。我们前期在结直肠癌细胞SW620中,瞬时过表达WTX后,检测细胞生物学功能变化,结果显示,在WTX过表达后,SW620细胞迁移能力下降。但是,本课题组在结直肠癌肿瘤组织中提取配对组织蛋白,做基因表达相关性分析时发现,WTX 基因表达与 EMT(Epithelial Mesenchymal Transition,上皮间质转化)相关蛋白,E-cadherin、N-cadherin、Vimentin等表达无明显相关性,提示WTX影响结直肠癌转移并非通过EMT相关路径。那么,WTX究竟在结直肠癌发生、发展中发挥什么作用?WTX是否影响了结直肠癌增殖、转移?若对肿瘤迁移有影响,而非通过EMT途径,那么其作用机制是什么?WTX发挥相关作用,是否有相互作用蛋白参与,调控的具体分子信号通路是什么?这些问题都有待明确。本课题拟通过检测WTX对结直肠癌生物学行为的影响,了解其与结直肠癌增殖、侵袭、转移的关系,通过筛选WTX相互作用蛋白及结直肠癌侵袭、转移相关的候选蛋白,探讨WTX参与结直肠癌侵袭和转移的分子路径,旨在阐释WTX在结直肠癌中的功能作用并揭示其参与肿瘤转移的分子机制,为临床肿瘤治疗提供新的分子靶点。研究方法1、WTX对结直肠癌生物学特性的影响(1)WTX过表达对结直肠癌细胞生物学特性影响1)利用WTX CDS区全长慢病毒载体感染WTX低表达结直肠癌细胞株SW620、HT29,构建稳定过表达细胞株,利用荧光定量PCR及westemblot检测WTX基因的表达。2)利用CCK8、平板克隆形成率和Transwell细胞迁移实验、划痕实验结合检测WTX基因过表达对SW620、HT29细胞增殖、侵袭能力的影响。(2)WTX沉默对结直肠癌生物学特性影响1)设计三个WTX干扰片段及一个阴性对照片段,将片段瞬时转染WTX高表达结直肠癌细胞SW480、HCT116,QPCR与Western blotting联合筛选WTX最有效干扰片段,送吉凯基因公司构建WTX有效沉默慢病毒载体,并包装成慢病毒上清液。2)利用WTX干扰慢病毒上清感染WTX高表达结直肠癌细胞株,荧光定量PCR及western blot检测WTX基因的表达。3)利用CCK8、平板克隆、Transwell细胞迁移实验、划痕实验结合检测WTX基因过表达对SW480\HCT116细胞增殖、侵袭能力的影响。2、WTX相互结合作用蛋白的筛选鉴定与调控机制分析(1)提取SW620-W+及HT29-W+细胞蛋白,以WTX特异性单克隆抗体作为“诱饵”行CO-IP实验,检测WTX与小G蛋白家族3个主要成员蛋白的直接结合作用,得到WTX相互作用蛋白CDC42;CO-IP与Con-focal验证WTX与CDC42的相互结合作用,Western blotting检测WTX结直肠癌重组稳定表达细胞株中,WTX表达改变前后,CDC42总表达及活性表达量变化。(2)WTX与CDC42相互结合结构域的初步分析。1)WTX除全长型外,在大多数细胞内存在另外2种亚型,一:在WTX基因N末端50～326AA缺失;二:在WTX基因C末端786～804AA与全长型碱基不同,而804～1135AA缺失。为了明确WTX与CDC42结合是否亚型特异性,首先将按WTX亚型序列构建1、2、3号三个亚型表达载体,将带Flag标签的截短子载体以阳离子脂质体法瞬时转染入结直肠癌SW620细胞,以Flag标签抗体为“诱饵”捕获CDC42,Western blotting检测三个亚型片段对CDC42的“捕获”情况;并transwell细胞迁移能力检测实验检测亚型载体瞬时转染对细胞迁移能力的影响。2)将WTX中间区域再次“截短”为长度不同的5个片段,设计并合成带特定酶切位点及Tag的引物,PCR扩增截短子片段,将产物插入GV141载体骨架(吉凯基因公司),测序鉴定,构建截短子质粒载体。将载体以阳离子脂质体法瞬时转染入结直肠癌SW620细胞,以Flag标签抗体为“诱饵”捕获CDC42,Western blotting检测可“捕获”CDC42的通道所对应的WTX片段区域。(3)WTX抑制CDC42活性的具体机制分析。1)根据文献,明确RhoGDIα可作为small GTPases家族三个主要成员包括CDC42的活性调节“开关”而发挥作用,它可以抑制RHO蛋白与GDP的解离及与GTP的结合,从而将RHO蛋白维持在失活形式。CO-IP检测WTX与RhoGDI相互结合关系,Con-focal辅助验证WTX与CDC42的结合。2)WTX与RhoGDI相互结合结构域的分析。利用已构建WTX截短子载体为“诱饵”,去“捕获”RhoGDIα,分析WTX-CDC42-RhoGDI 结合模式。3)CO-IP进一步分析,WTX-CDC42-RhoGDI三者作用模式。分别设计CDC42及RhoGDIα干扰片段各3个及一个阴性对照片段,将片段瞬时转染SW620-W+细胞,QPCR与Western blotting联合筛选CDC42/RhoGDIα最有效干扰片段(沉默效果>50%)。将SW620-W+细胞分为三组,以阳离子脂质体法分别瞬时转染NC、Si-CDC42或Si-RhoGDIα,提取细胞蛋白,在Si-CDC42组细胞中,以WTX为“诱饵”去“捕获”RhoGDIα;在Si-RhoGDIα组细胞中,以WTX为“诱饵”去“捕获”CDC42,检测分析WTX与CDC42/RhoGDIα三者作用模式,WTX与CDC42/RhoGDIα 结合是否以 RhoGDIα/CDC42 为中介?3、WTX-CDC42在结直肠癌细胞迁移中作用(1)“rescue”实验明确WTX与CDC42上、下游关系1)根据预测WTX可能与CDC42存在负性调节关系,在SW620-W+细胞中,双重过表达CDC42,CCK8及transwell实验检测双过表达细胞SW620-W+C+与对照细胞SW620-W+、SW620-N1相比,增值、侵袭能力“恢复”情况。2)在SW480-W-细胞中,双重沉默CDC42,CCK8与transwell实验检测双干扰细胞SW480-W-C-与对照细胞SW480-W-、SW480-N1相比,增值、侵袭能力“恢复”情况。(2)鬼笔环肽标记F-actin,在WTX过表达及沉默表达细胞组(SW620-W+/N1与SW480-W-/N1)中,利用免疫荧光观察细胞actin骨架形态变化。用 mDia2/Fmnl2+F-actin 双色标记 filopodia,用 Arp2/3+F-actin 双标记lamellipodia,用 α-actinin+myosinⅡA 双标记应力纤维,用 paxillin+myosinⅡA 双标记黏着斑,免疫荧光分析WTX-CDC42影响结直肠癌细胞actin骨架的具体形式。(3)WTX调节结直肠癌细胞actin骨架形态变化的具体作用通路利用Western Blot检测WTX过表达及干扰细胞株中中CDC42下游MRCK、LIMK1/2、p-Cofilin、p-moesin、p-MLC等蛋白质的表达变化,筛选并分析得到结直肠内WTX下游影响细胞actin骨架形态变化的作用信号通路。4、统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。荧光定量PCR结果比较2-△△Ct值采用单样本T检验(One-Sample T Test)分析;Transwell迁移实验、平板克隆形成实验根据分组量采用两独立样本t检验(Independent-Samples T test)或单因素方差分析(One-Way ANOVA)法进行分析。CCK8体外增殖及裸鼠皮下成瘤实验采用析因设计(Factorial design analysis of variance)的方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。研究结果1、WTX对结直肠癌生物学特性的影响(1)利用慢病毒感染构建结直肠癌WTX基因稳定过表达/阴性对照细胞株HT29-W+/HT29-N1 和 SW620-W+/SW620-N1。荧光定量 PCR 鉴定 HT29-W+与 HT29-N1、SW620-W+与 SW620-N1 之间WTX的表达差异,结果显示两种细胞系之间WTX表达差别明显,有统计学意义(t= 46.9,P<0.001;t= 17.575,P<0.01);Western blot 检测证实HT29-W+/SW620-W+细胞组WTX基因的表达量较HT29-N1/SW620-N1明显升高,HT29-W+/HT29-N1、SW620-W+/SW620-N1 细胞稳定株构建成功。(2)设计三个WTX干扰片段分别命名为WTX SI-1、SI-2、SI-3,瞬时转染SW480及HCT116细胞株后,QPCR结果提示,片段SI-1沉默效果最佳,干扰效率>50%,Western blotting与QPCR结果一致,SI-1选作后续用WTX干扰序列。将WTXSI-1序列送上海吉凯基因技术公司,包装WTX干扰慢病毒载体。利用WTX干扰慢病毒感染结直肠癌SW480、HCT116细胞,构建SW480-W-/SW480-N1、HCT116-W-/HCT116-N1 两组稳定沉默细胞株;荧光定量 PCR 鉴定 SW480-W-与 SW480-N1、HCT116-W-与 HCT116-N1 之间 WTX 的表达差异,结果显示两组细胞系之间WTX表达差别明显,有统计学意义(t=-8.973,P<0.05;t=-22.420,P<0.01);Western blot 检测证实SW480-W-/HCT116-W-细胞组 WTX 基因的表达量较 SW480-N1/HCT116-N1 明显降低,提示WTX结直肠癌细胞干扰稳定株构建成功。(3)WTX过表达或沉默前后,CCK8、平板克隆实验测细胞体外增殖能力CCK8 结果示:WTX 沉默后,SW480-W-/SW480-N1、HCT116-W-/HCT116-N1细胞中2组的生长时间水平差异具有统计学意义(F=l 170.056,P<0.001;F=1167.374,P<0.001);各时间2组细胞间差异具有统计学意义(F=335.429,P<0.001;F=177.889,P<0.001);WTX 过表达后,HT29-N1/HT29-W+、SW620-W+/SW620-N1细胞中2组的生长时间水平差异具有统计学意义(F=652.200,P<0.001;F=802.765,P<0.001);各时间2组细胞间差异具有统计学意义(F=277.843,P<0.001;F=133.312,P<0.001)。平板克隆结果示:WTX稳定过表达后,HT29-N1/HT29-W+细胞组和SW620-N1/SW620-W+组的克隆形成率分别为61%/14.67%、45%/22%,差异具有统计学意义(T=13.998,P<0.001;T=26.039,P<0.001);WTX稳定沉默表达后,SW480-N1/SW480-W-细胞组和HCT116-N1/HCT116-W-组的克隆形成率分别为 25.2%/61.13%、29.47%/73.53%,差异具有统计学意义(T=-12.013,P<0.001;T=-17.742,P<0.001)。以上实验结果提示:转入WTX基因后,SW620、HT29细胞增殖能力明显减弱;沉默WTX基因后,SW480、HCT116细胞增值能力增强。(4)WTX过表达或沉默前后,transwell、划痕实验测细胞体外迁移能力transwell 示:WTX 过表达后,HT29-W+/SW620-W+细胞组较 HT29-N1/SW620-N1细胞组迁移能力明显减弱,差异具有统计学意义(t=8,798,p<0.001;t=21.985,p<0.001);WTX 沉默后,SW480-W-/HCT116-W-组较SW480-N1/HCT116-N1细胞组迁移能力明显增强,差异均具有统计学意义(t=-13.770,p<0.001;t=-8.711,p<0.001)。划痕实验结果示:WTX过表达后,HT29-W+/SW620-W+组划痕后72h细胞间距明显宽于 HT29-N1/SW620-N1 组;WTX沉默后,SW480-W-/HCT116-W-组划痕后 48～72h 细胞间距明显窄于 SW480-N1/HCT116-N1 组。上述实验结果表明,转入WTX基因后,结直肠癌细胞SW620、HT29体外迁移能力降低;沉默WTX基因后,结直肠癌细胞SW480、HCT116体外迁移能力增强。2、WTX相互结合作用蛋白的筛选鉴定与调控机制分析(1)以WTX看克隆抗体为“诱饵”,行CO-IP(免疫共沉淀)检测WTX与小G蛋白家族主要成员CDC42、RAC1、RhoA的相互结合作用,结果显示:WTX与小G蛋白家族成员CDC42有相互结合作用,而与RAC1、RhoA无直接结合作用。Con-focal验证WTX与CDC42的结合作用,结果显示:在结直肠癌SW620与SW480细胞株中,WTX与CDC42在细胞浆内存在共定位。且在SW620中,WTX与CDC42的结合在SW620-W+中明显弱于SW620-N1细胞;而在SW480细胞中,WTX与CDC42在SW480-W-中的结合明显强于SW480-N1细胞。Western blotting检测CDC42总表达及活性表达量,结果显示:WTX过表达后,CDC42活性表达量(GTP-boundCDC42)降低;而WTX沉默表达后,CDC42活性量增高,而总表达量均无明显差异。提示:WTX可以负向调控CDC42活性。(2)WTX与CDC42相互结合结构域的初步分析。1)构建WTX三个亚型载体,PCR扩增片段,将片段插入GV141载体,行后双酶切琼脂糖凝胶电泳初步鉴定,结果提示扩增载体片段长度与分别预期相符合,将初步质粒载体转化大肠杆菌DH5α,摇菌提取质粒测序,测序结果示载体系列与NCBI公布匹配,WTX1、2、3号三个亚型载体构建成功。2)将3个亚型载体及阴性对照载体瞬时转染SW620细胞,transwell实验检测细胞细胞迁移能力变化,结果显示:1、2、3号载体瞬时转染SW620细胞后,与阴性对照组相比,细胞迁移能力均出现下降,差异具有统计学意义(F=19.747,P<0.001);提取转染了 3个亚型载体的SW620细胞蛋白行CO-IP实验,结果显示:三组细胞中WTX均可以沉淀CDC42,但是在转染3号载体的细胞中,WTX沉淀CDC42的能力明显低于1、2号载体组。3)将WTX中间区域再次“截短”构建成5个不等长度的片段,PCR扩增片段,将片段插入GV141载体,行后双酶切琼脂糖凝胶电泳初步鉴定,结果提示扩增“截短子”片段长度与预期相符合,将初步质粒载体转化大肠杆菌DH5α,摇菌提取质粒测序,测序结果示“截短子”序列与NCBI公布匹配,WTX“截短子”载体构建成功。4)用5个截短子片段分别沉淀CDC42,综合分析可沉淀CDC42的WTX片段区域,CO-IP结果示:WTX与CDC42结合是通过WTX N端327-716AA位点。(3)WTX抑制CDC42活性的具体机制。1)CO-IP结果显示,以WTX抗体作为“诱饵”,可以成功捕获RhoGDIα,提示RhoGDIα为WTX另一个直接结合作用蛋白。2)设计CDC42与RhoGDIα沉默siRNA片段各3个,分别命名为CDC42 SI-1、SI-2、SI-3,RhoGDIα SI-1、SI-2、SI-3,将片段瞬时转染 SW480 及 SW620 细胞株后,QPCR结果提示,CDC42片段SI-1及RhoGDIα SI-1、SI-2沉默效果效率>50%,Western blotting与QPCR结果一致,两个基因均选用SI-1作后续实验。WTX-RhoGDIα-CDC42 三者 CO-IP 结果示:沉默 CDC42 以后,WTX 与RhoGDIα结合没有明显变化;但是,沉默RhoGDIα后,WTX与CDC42结合减弱,但是依旧存在结合。结合“截短子”实验结果,该两部分实验提示:WTX部分通过RhoGDIα与CDC42相结合,RhoGDIα是部分WTX与CDC42相结合作用的中介。3)截短子分析结果显示,WTX与RhoGDIα发生结合片段,与WTX结合CDC42的片段一致,提示WTX-RhoGDIα-CDC42三者“复合物”的存在形式。以上结果综合提示:WTX与CDC42/RhoGDIα结合需要以另外一个蛋白即RhoGDIα/CDC42为中介。(WTX可能正向“维持”RhoGDIα与CDC42的结合,抑制CDC42从GDP-bound的“失活”形式向GTP-bound的“活性”形式转换。)3、CDC42在结直肠癌迁移中的作用(1)“rescue”实验明确WTX与CDC42上、下游关系1)在SW620-W+细胞中,双重过表达CDC42后,SW620-W+C+组与对照组细胞 SW620-N1、SW620-W+细胞组相比,CCK8 结果示:SW620W+C+/SW620W+/SW620-N1细胞中3组的生长时间水平差异具有统计学意义(F=1557.996,P<0.001);各时间3组细胞间差异具有统计学意义(F=148.127,P<0.001);生长时间与组间交互作用差异具有统计学意义(F=18.913,P<0.001)。结果提示:在转入WTX基因后,SW620细胞增殖能力减弱;但当同时转入WTX与CDC42时,被抑制的SW620细胞增值能力有所“回复”。transwell示:SW620W+细胞组迁移能力最弱,其次为SW620W+C+组,对照组细胞SW620-N1组最强,差异具有统计学意义(F=116.901,p<0.001)。提示:在转入WTX基因后,SW620细胞迁移能力减弱;但当同时转入WTX与CDC42时,被抑制的SW620细胞迁移能力有所“回复”。2)在SW480-W-细胞中,双重沉默CDC42后,SW480-W-C-组与对照组细胞SW480-N1、SW480-W-细胞组相比,CCK8 结果示:SW480W-C-/SW480W-/SW480-N1细胞中3组的生长时间水平差异具有统计学意义(F=672.235,P<0.001);各时间3组细胞间差异具有统计学意义(F=362.501;P<0.001);组间与生长时间交互作用差异具有统计学意义(F=57.727,P<0.001)。结果提示:在沉默WTX基因后,SW480细胞增殖能力增强;但当同时沉默WTX与CDC42时,被促进的SW620细胞增值能力有所“回复”。transwell示:SW480W-细胞组迁移能力最强,其次为SW480W-C-组,对照组细胞SW480-N1组最低,差异具有统计学意义(F=225.470、p<0.001)。提示:在沉默WTX基因后,SW480细胞迁移能力增强;但当同时沉默WTX与CDC42时,被抑制的SW480细胞迁移能力有所“回复”。以上结果提示,CDC42为WTX直接结合作用蛋白,且CDC42位于WTX下游信号通路,CDC42的表达变化可以“逆转”上游WTX蛋白表达失调所引起的结直肠癌增值、侵袭能力变化。(2)免疫荧光结果观察到,在SW480细胞中,当WTX被沉默后,与对照组细胞相比,细胞内部及周边出现丝状、束状的ACTIN骨架纤维明显增加;在SW620细胞中,当过表达WTX后,与对照组细胞相比,细胞膜周边丝状的骨架纤维明显减少。结果提示,WTX对结直肠癌细胞ACTIN骨架组装存在负向调控作用。(3)在SW620N1/SW620W+、SW480N1/SW480W-细胞组中,免疫荧光双色标记丝状伪足、层状伪足、应力纤维及黏着斑,观察到与对照组细胞相比,WTX过表达或沉默后,细胞丝状伪足、层状伪足形成数量并无明显变化;但是,WTX沉默后,细胞应力纤维及黏着斑形成明显增加。(4)Western Blotting检测到 WTX沉默后,WTX/CDC42下游MRCK、LIMK1/2、p-cofilin 表达增加,WTX 过表达后 WTX/CDC42 下游 MRCK、LIMKI/2、p-Cofilin、表达下调,而mDia2、Fmnl2表达无明显变化。且结直肠癌组织中,QPCR检测并分析WTX与MRCKα表达相关性,结果提示二者mRNA水平表达负性相关,相关系数0.72。以上提示结直肠癌细胞中,WTX通过WTX—GTP-CDC42—MRCK—LIMK1/2—p-Cofilin—F-actin polymerization 信号通路调节结直肠癌细胞actin骨架形态变化。研究结论1、证实WTX具有抑制结直肠癌细胞增殖及侵袭作用;2、WTX通过RhoGDIα与CDC42相结合作用,抑制CDC42活性,从而调节结直肠癌细胞骨架活动,抑制结直肠癌侵袭、转移;3、WTX 通过 WTX—GTP-CDC42—MRCK—LIMK1/2—p-Cofilin—F-actin 信号通路抑制结直肠癌细胞应力纤维及黏着斑等微丝骨架的组装形成,从而抑制肿瘤细胞迁移、侵袭。