肠道病毒71型（Enterovirus71,EV71）属于小RNA病毒科,是引起婴幼儿手足口病的主要病原体,会导致严重的神经系统疾病,如无菌性脑膜炎,脑炎,脊髓灰质炎样麻痹,严重者可导致死亡。小RNA病毒衣壳蛋白对于病毒包装、侵入来说至关重要,然而在EV71病毒中,衣壳蛋白上,特定氨基酸位点对病毒功能方面的影响还知之甚少。基于对其他小RNA病毒衣壳蛋白的研究可知,VP0豆蔻酰化位点影响病毒的入侵和脱衣壳过程;VP0裂解位点影响病毒衣壳的组装和成熟。然而对于EV71病毒来说,这两类氨基酸位点的位置与功能未见报道,所以弄清其作用机制对EV7病毒的预防与抗病毒药物发现至关重要。所以本论文对这两类位点进行了研究,分别分为对豆蔻酸结合位点的研究和衣壳蛋白VP0裂解位点的研究两部分。第一部分:豆蔻酸结合位点对EV71病毒侵入的影响豆蔻酰化是蛋白N末端与豆蔻酸共价连接的过程,一些文献报道,小RNA病毒的豆蔻酰化影响病毒组装和感染力,是影响病毒生命周期的一个重要氨基酸位点。在EV71病毒中,发生豆蔻酰化的位点是VP4 N末端的第二位甘氨酸。首先,我们构建了带有报告基因的EV71豆蔻酰化缺失型假病毒（Luciferase reporter G2A pseudovirus,Pseudo-G2A）和豆蔻酰化缺失型活病毒全长表达质粒（Live G2A virus,Live-G2A）,通过将质粒转染239T细胞,获得了豆蔻酰化缺失的报告假病毒和豆蔻酰化缺失型活病毒,对病毒蛋白的western-blot检测和病毒外观的电镜观察,发现豆蔻酰化的缺失对病毒的蛋白表达和病毒颗粒的外观并不影响。其次,我们将豆蔻酰化缺失型假病毒和活病毒分别感染293S（稳定表达EV71受体SCARB2）细胞。发现假病毒感染后Luciferase表达水平与野生型相比降低了500倍,病毒基因组RNA含量降低50倍。在活病毒感染中,豆蔻酰化缺失的活病毒感染细胞组始终未出现CPE现象,并且western-blot方法也检测不到细胞内病毒蛋白的存在。通过病毒感染细胞后将细胞进行盲传2代,测量各代细胞内病毒RNA含量并进行免疫荧光分析病毒蛋白发现,豆蔻酰化的缺失严重阻碍了病毒核酸的复制,并极大抑制了病毒子代的合成。综上,豆蔻酰化的缺失严重的降低了病毒的感染力。接着,为了进一步说明豆蔻酰化缺失抑制病毒核酸复制的机制,我们分别做病毒的单轮和多轮生长曲线,结果表明,豆蔻酰化缺失抑制了病毒基因组RNA的复制;同时病毒的负链RNA含量也严重受限。提示其机制为,在病毒复制过程中病毒无法合成负链RNA,而影响了病毒感染的早期过程。最后,有文献报道提示,豆蔻酰化介导鼻病毒膜融合,我们假设豆蔻酰基团的作用是与细胞内的膜结构融合从而介导病毒感染时的基因组RNA脱衣壳。为了验证这一假设,我们构建了豆蔻酰化缺失的VP4-EGFP融合表达质粒（VP4-G2A-EGFP）,转染239T细胞后共聚焦免疫荧光观察发现,与野生型VP4-WT-EGFP聚集在特定细胞器的分布特点相比,豆蔻酰化缺失型VP4-EGFP基本都分散在细胞质中。为更详细地说明,我们分别将转染质粒的细胞进行了质膜分离,通过western-blot检测显示,野生型VP4-EGFP大都分布在膜结构中,而豆蔻酰化缺失型VP4-EGFP则主要分布在细胞质中,说明豆蔻酰化影响VP4的亚细胞定位。此外,为了直接探究豆蔻酰基团的膜渗透功能,我们人工合成了EV71-VP4-WT和EV71-VP4-G2A多肽,通过与含有发光化合物脂质体的渗透实验表明,豆蔻酰基团直接与膜相互作用使膜通透,可能为细胞内吞后病毒脱衣壳和基因组注入细胞质创造条件。综上所述,我们证明EV71 VP4 N末端的豆蔻酰基团与膜结构直接相互作用,可能为细胞内吞后病毒脱衣壳和基因组注入细胞质的必要条件。所以,豆蔻酰化的缺失阻碍了EV71负链RNA的合成和病毒基因组的复制,严重降低了病毒的感染力。但豆蔻酰化的缺失不影响病毒的蛋白表达与病毒颗粒的外观形态。第二部分:VP0裂解位点对EV71组装的影响衣壳蛋白VP0裂解为VP4和VP2是小RNA病毒组装的关键步骤。只有完成VP0裂解,病毒才具有感染性。然而目前还没有确定EV71 VP0的裂解位点以及推动这一行为的作用力。已有研究表明VP0裂解位点两侧的氨基酸残基突变会导致VP0裂解不完全裂解或不裂解,但对裂解位点的不同突变所产生的影响并没有细致的研究。我们首先通过对野生型EV71和纯化的EV71 VLP的质谱对比分析,确定了EV71 VP0裂解位点位于69K/70S。其次,通过构建,我们获得了VP0裂解位点69K和70S的不同突变型质粒,将质粒转染293T细胞后,收上清液感染293S细胞。对感染细胞核酸和蛋白水平上的检测,发现单突变69K,包括T69S70、P69S70组,病毒复制量未受影响;单突变70S组和双突变组,包括K69A70、K69T70、T69P70和F69K70组,病毒复制量严重降低,并且细胞未出现CPE的现象,胞内也检测不到病毒蛋白。根据以上结果发现,只要突变70S位点,病毒就不能组装,进而失去了感染力。所以本研究确定了70S对病毒组装是不可或缺的。最后,我们也对VP0裂解机制进行了初步研究。我们将构建的EV71病毒蛋白酶,2A^pro和3C^pro与VP0质粒共转染。检测其对VP0是否有切割作用,通过western-blot检测,发现2A^pro和3C^pro并不参与VP0的裂解。综上所述,该部分研究证明了,VP0裂解位点位于69K/70S,通过病毒核酸和蛋白水平的检测;证明了70S位点对EV71病毒组装和感染力影响较大;最后通过对VP0裂解机制的研究,证实了2A^pro和3C^pro并不参与VP0的裂解。本论文证明了,衣壳蛋白VP0上的豆蔻酸结合位点和VP0裂解位点影响EV71病毒的组装、侵入和感染力等方面。对其机制研究推测,豆蔻酰化缺失影响病毒侵入过程中与病毒脱壳相关膜的相互作用,使得病毒无法完成脱衣壳,病毒负链RNA无法合成,进而抑制病毒RNA的复制,最终导致病毒感染力的降低。VP0裂解位点位于K69和S70,并且S70氨基酸位点对病毒的组装和成熟更为重要。EV71病毒的2A^pro和3C^pro并不参与VP0的裂解过程。