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病毒结合到宿主细胞表面然后进入细胞内的这一过程包含了多种因素的参与,其中病毒受体在这一过程起到关键作用,但病毒侵染细胞的过程中不止利用一种受体。探明病毒的受体对理解病毒的入侵过程、新型抗病毒药物的研发有重要作用。家蚕质型多角体病毒(BmCPV)为呼肠孤病毒科(Reovirddae)质型多角体病毒属(Cypovirus)的模式种,BmCPV特异性感染家蚕中肠细胞,引起家蚕中肠型脓病的发生,导致蚕茧产量歉收。目前有关BmCPV的研究大多集中在病毒的形态结构、病毒基因的功能以及家蚕对BmCPV的感染应答等方面,而有关BmCPV的受体以及进入细胞的分子机制方面研究几乎还没有涉及。为了探讨BmCPV的感染机制,我们曾通过免疫共沉淀(Co-IP)、病毒覆盖蛋白结合法(VOPBA)、PVDF膜上蛋白相互作用等方法获得了 BmCPV的一些候选受体蛋白以及可能与BmCPV互作的宿主蛋白。为了进一步探讨这些蛋白在BmCPV入侵细胞中所扮演角色,在本研究中,通过RNAi分别抑制唐氏综合征细胞黏附分子-1(Down syndrome cell adhesion molecule-1,Dscam)、表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor,EGFR)、血管内皮生长因子受体-1(vascular endothelial growth factor receptor 1,VEGFR)、G 蛋白偶联受体-125(G-protein coup led receptor 125,GPCR-125)、烟碱乙酰胆碱受体亚基β2(nAChR subunit beta 2,nAChR b2)、7 跨膜超家族成员 3(transmembrane 7 superfamily member 3,TM7SF3)、CD63 抗原(CD63antigen,CD63)、分拣蛋白相关受体(sortilin-related receptor,SOR)、热激蛋白 70 同源蛋白(heat shock 70 kD protein cognate,HSC70)、受体表达增强蛋白 4(receptor expression-enhancingprotein 4,REEP4)和清道夫受体B 型 1(scavengerreceptor class B member 1,SCRB)、Nogo 受体-1(Nogo receptor-1,NgR1)和闭锁小带蛋白同型 X1(tight junction protein Zonula occludens-1 isoform X1,BmZo-1)基因表达对细胞感染BmCPV的影响,结果显示沉默上述基因的表达均不同程度地降低细胞对BmCPV的感染性,其中沉默REEP4、SOR、VEGFR、HSC70和BmZO-1基因对细胞感染BmCPV的影响最大。将上述5个基因的编码区的部分序列分别克隆进原核表达载体在大肠杆菌中进行表达,用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。抗体封闭试验结果显示,用以上5种蛋白的抗体封闭细胞后,细胞对BmCPV的感染性均明显下降,表明这些蛋白可能是BmCPV受体复合物的成员之一或作为BmCPV的互作蛋白在病毒感染过程中发挥重要作用。前人的研究发现酪氨酸蛋白激酶Src家族64b(tyrosine-protein kinase TPK Src64B-like,Src)和整联蛋白 β1(Integrinβsubunit1,Integrin)在哺乳类 Reovirus侵染细胞过程中扮演着很重要的角色。Reovirus利用Integrinβ1通过网格蛋白介导的内吞途径内化进入细胞。受体激活蛋白激酶C(Receptor for activated protein kinase C,RACK1)能与Src64B和整联蛋白结合,推测Src64B-like可能通过integrin-RACK1-Src轴在BmCPV入侵过程中发挥功能。为了探讨BmCPV与Src和Integrin的互作,本研究通过免疫荧光检测了 BmCPV与Src和Integrin的互作,发现在细胞中BmCPV可与Integrin共定位。BmCPV分别感染Src和Integrin转化细胞,发现上调Src和Integrin表达可增加细胞对BmCPV的感染性。抗体封闭试验结果显示,用Integrin抗体处理细胞可阻止BmCPV对细胞的感染,表明Integrin可与BmCPV直接互作,而Src与BmCPV可能通过Integrin间接互作,并且在BmCPV入侵细胞过程中发挥作用。业已明确细胞表面的神经节苷酯(gangliosides)为哺乳动物呼肠孤病毒(Reovirus)和轮状病毒(Rotavirus)的共受体,但至今不明细胞表面的糖酯能否作为BmCPV的共受体。本研究发现唾液酸酶处理可降低BmN细胞对BmCPV的感染性;用不同浓度 Ganglioside GM1、ganglioside GM2、Ganglioside GM3 处理BmCPV病毒粒子,发现GM2处理的BmCPV对细胞感染性下降;进一步用Ganglioside GM2 抗体封闭细胞表面的 GM2,Real-time PCR 和 Western blotting 检测结果显示,细胞对BmCPV的感染能力下降。上述结果表明GM2是BmCPV的共受体。我们曾利用Co-IP、VOPBA、pull-down等方法从提取的细胞膜蛋白中筛选BmCPV候选受体,但此方法的筛选效率较低、鉴定工作量大。BmCPV在感染细胞过程中首先吸附在中肠组织的刷状缘,因此,在本研究中,提取家蚕中肠组织的刷状缘膜囊泡(brushborder membrane vesicle,BBMV)蛋白,经双向电泳分离后,通过病毒覆盖蛋白结合法(VOPBA)筛选分离与BmCPV互作的中肠组织微绒毛膜蛋白。通过质谱法共鉴定到11种蛋白,其中,类转铁蛋白(transferrin-like,BmTF)、普通嗅觉结合蛋白(general odorant-binding protein 71,OBP71)和 ABC转运蛋白家族 G 成员 23 样蛋白(ABC transporter G family member 23-like,BmABCG23)具跨膜结构,丝氨酸蛋白酶抑制剂-19(serpin-19)、含CAP-Gly结构域的接头蛋白(CAP-Gly domain-containing linker protein,CLIP)、神经 蛋白同源体(neurocalcin homolog,BmNCA)、类成虫盘生长因子(imaginal disk growth factor,BmIDGF)、固醇载体蛋白 X(sterol carrier protein x,SCP-X)、筑丝蛋白 B1(tektin-B1)和类突触结合蛋白C(synaptotagmin-C-like,BmSytC)为膜外蛋白。初步分析结果显示,OBP71可能为BmCPV的受体复合体的成员,BmABCG23和家蚕SCP-X通过介导胆固醇的转运参与BmCPV的细胞入侵,CLIP、tektin-B1可能参与BBMV的胞内转运,NCA和BmSytC可能参与BmCPV的内吞过程中的钙离子转运,而BmTF作为BBMV的结构成份与BmCPV的内吞关联。