论文部分内容阅读
背景:胆管癌是一种临床治疗效果极差的消化道恶性肿瘤,发病率有逐年升高的趋势,严重危害着人类的健康与生命,目前尚不能明确其癌变的分子机制。肿瘤的分子靶向治疗一直是肿瘤研究的热点,SIRT1被广泛研究于多种类型的肿瘤,但仍颇具争议,SIRT1在胆管癌中的研究可能为胆管癌的发病机制及分子治疗提供新的思路。目的:比较两种胆管癌细胞(QBC939和HuCCT1)与正常胆管上皮细胞(HIBEpic)中 SIRT1 的表达水平,验证 SIRT1 siRNA(small interfering RNA,小干扰RNA)的干扰效应,探讨下调SIRT1基因的表达对胆管癌细胞增殖、凋亡及迁移能力的影响。方法:分别采用荧光实时定量PCR(Real-time,RT-PCR)和免疫印迹法(Westernblot)比较胆管癌细胞与正常胆管上皮细胞SIRT1的表达情况。应用RNA干扰技术下调胆管癌细胞内SIRT1的表达,将阴性对照siRNA(si-Control)和两条SIRT1 siRNA(si-SIRT1#1和si-SIRT1#2)经脂质体转染人胆管癌细胞株QBC939 和 HuCCT1,分为阴性对照组(control)和 SIRT1 siRNA 转染组 1(sil)、SIRT1 siRNA 转染组 2(si2),利用 RT-PCR(Real-time PCR)以及 Westernblot技术鉴定小干扰RNA的干扰效果。转染后采用CCK8法和平板克隆形成实验检测胆管癌细胞增殖能力的变化;流式细胞术检测胆管癌细胞凋亡率的改变;Transwell迁移实验检测胆管癌细胞迁移能力;Western blot检测下调SIRT1的表达后胆管癌细胞中凋亡相关蛋白Survivin、Bax、Cleaved PARP及上皮标志蛋白E-cadherin和间质标志蛋白N-cadherin、Vimentin的表达变化。结果:两种胆管癌细胞中SIRT1的表达在RNA水平和蛋白水平都较正常胆管上皮细胞高(P<0.05)。与转染阴性对照siRNA细胞相比较,转染针对SIRT1的小干扰RNA(si-SIRT1#1和si-SIRT1#2)的胆管癌细胞中,SIRT1基因mRNA和蛋白表达水平都显著降低(P<0.05)。抑制两株胆管癌细胞中SIRT1基因的表达后,CCK8实验中检测的细胞存活率明显降低(P<0.05)、平板克隆形成实验中可以观察到胆管癌细胞的集落形成数量显著减少(P<0.05),也就是说胆管癌细胞的增殖能力在下调SIRT1的表达后受到了明显的抑制;同时,流式细胞检测术所测的细胞凋亡率显著增加(P<0.05);Transwell迁移实验中SIRT1 siRNA干扰组中能够穿过滤孔膜到达下室的细胞数也显著减少(P<0.05),细胞的迁移能力明显减弱;进一步通过Western blot检测发现下调胆管癌中SIRT1基因表达水平可显著下调Survivin、间质标志物N-cadherin、Vimentin蛋白表达,上调 Bax、Cleaved PARP 及上皮标志物 E-cadherin 的表达(P<0.05)。结论:SIRT1在两种胆管癌细胞株中高表达,提示SIRT1在胆管癌中可能是癌基因,能够促进胆管癌的发生与发展。针对SIRT1的小干扰RNA可以显著抑制胆管癌细胞中SIRT1的表达。下调胆管癌细胞中SIRT1的表达水平可以明显的抑制细胞的增殖及迁移能力、诱导胆管癌细胞发生凋亡,其机制可能与下调Survivin、上调Bax蛋白的表达,抑制EMT的发生有关。SIRT1可能是胆管癌分子治疗的一个潜在新靶点。