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目的:探讨蚯蚓纤溶酶(earthworm fibrinolytic enzyme,EFE)对人肝癌细胞的增殖是否具有抑制作用,及其对粘附分子CD44v6表达的影响。
方法:(1)体外实验:体外培养人肝癌SMMC-7721细胞,分为对照组和不同浓度EFE组,采用WST-1法检测细胞增殖抑制率,并采用RT-PCR方法检测CD44v6mRNA的表达情况,Western Blot法观察各组细胞CD44v6蛋白表达的变化。(2)体内实验:建立SMMC-7721细胞裸鼠移植瘤模型,随机分为生理盐水组、EFE组、5-Fu组及EFE+5-Fu联合用药组,分别处理4周后,剥离肿瘤组织,计算瘤重抑制率;并采用RT-PCR方法检测EFE组CD44v6 mRNA的表达情况,免疫组化和Western Blot方法观察各组EFE对CD44v6蛋白表达的影响。同时进行肝肾组织HE染色,评价药物毒副反应。
结果:(1)体外实验:EFE作用于SMMC-7721细胞株24、48、72小时的IC50分别为7.86、5.67、4.23 uku/ml,细胞增殖抑制率结果提示EFE对SMMC-7721细胞的抑制作用在一定浓度范围内呈时间剂量依赖关系。RT-PCR结果显示,与对照组相比,3、4、5 uku/ml浓度的EFE作用48h后,CD44v6 mRNA表达量分别下调14.56%、27.11%、38.70%,差异均有显著统计学意义(P均<0.01)。Western Blot结果表明,3、4、5 uku/ml浓度的EFE作用48h后,CD44v6蛋白的表达量与对照组相比分别下调14.47%、31.07%、56.60%,差异均有统计学意义(P均<0.05)。(2)体内实验:与生理盐水组相比,EFE组、5-Fu组及联合用药组抑瘤率分别为20.53%、23.07%和54.20%;免疫组化和Western Blot结果显示,EFE组CD44v6蛋白的表达水平较生理盐水组分别下调47.16%、28.37%(P均<0.05)。RT-PCR结果表明,EFE组CD44v6 mRNA的表达水平亦较生理盐水组下调16.44%(P<0.05)。肝肾组织HE染色未见明显异常。
结论:蚯蚓纤溶酶在体内外对人肝癌细胞株SMMC-7721的增殖均具有明显的抑制作用,同时EFE可显著抑制粘附分子CD44v6的表达,提示EFE不仅具有抑制肝癌细胞生长作用,可能还具有潜在的抗肝癌细胞粘附、侵袭作用。