【摘 要】
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水产品营养丰富,富含高品质蛋白、脂肪和矿物质,其肉质柔软且水分含量高,在储存、运输和贩卖过程中易受到微生物和内源性蛋白酶的影响,进而导致新鲜度下降,品质降低。因此,水产品的新鲜程度是评价水产品品质最为重要的指标之一。水产品新鲜度的评价方法众多,但这些方法存在一定弊端,如检测仪器复杂、样品前处理过程繁琐、检测成本较高等。生物传感器法具有操作简单,检测特异性高等特点,近年来开始应用于水产品新鲜度评价。
【基金项目】
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国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”专项项目“水产品危害物质检测与质量控制技术”
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水产品营养丰富,富含高品质蛋白、脂肪和矿物质,其肉质柔软且水分含量高,在储存、运输和贩卖过程中易受到微生物和内源性蛋白酶的影响,进而导致新鲜度下降,品质降低。因此,水产品的新鲜程度是评价水产品品质最为重要的指标之一。水产品新鲜度的评价方法众多,但这些方法存在一定弊端,如检测仪器复杂、样品前处理过程繁琐、检测成本较高等。生物传感器法具有操作简单,检测特异性高等特点,近年来开始应用于水产品新鲜度评价。次黄嘌呤,是水产品死亡后ATP的代谢产物,是水产品品质变化早期的标志物。本论文基于次黄嘌呤建立了两种生物传感方法,通过将新鲜度的生化信号转化为肉眼可见的颜色信号,实现了水产样品的可视化评价。具体研究内容和结果如下:1.基于黄嘌呤氧化酶一级硫酸铵悬液（Xanthine Oxidase Ammonium Sulfate Suspension Grade I,XOD-ASS）的过氧化物酶活性建立了次黄嘌呤比色检测法。研究发现,XOD-ASS具有过氧化物酶活性,在过氧化氢（H2O2）存在时,催化显色底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）生成氧化型TMB（ox TMB）,产生肉眼可见的蓝色,同时在652nm处产生特征吸收峰。基于这个发现,建立了基于XOD-ASS的一步法次黄嘌呤检测体系。在此检测体系中,XOD-ASS首先行使黄嘌呤氧化酶活性,催化次黄嘌呤转化为黄嘌呤和尿酸,同时生成H2O2;XOD-ASS再发挥过氧化物酶活性,生成ox TMB,实现了对次黄嘌呤的一步比色检测。本方法在靶标浓度为20μM~100μM时具有良好的线性,R2为0.998,检出限为6.93μM。将本方法应用于海鲈鱼样品次黄嘌呤含量的测定,加标回收率在97.44%~102.56%之间,实现了对海鲈鱼样品新鲜度的评价。2.基于酶固定化技术研制了对次黄嘌呤响应的纸基芯片。该芯片基于多糖修饰硝酸纤维素（NC）膜形成的微流体聚集效应,将黄嘌呤氧化酶（XOD）、辣根过氧化物酶（HRP）和TMB组成的双酶显色体系固定在NC膜上。XOD首先催化次黄嘌呤转化为黄嘌呤和尿酸,生成H2O2,之后HRP酶催化H2O2氧化TMB生成ox TMB,产生肉眼可见的蓝色,实现了颜色信号的输出。本方法检测次黄嘌呤在0.01 m M~0.16 m M的浓度范围内具有较好的线性,R2为0.9903,检测限为8.22μM,加标回收率在96.13%~103.11%之间。该纸基芯片可以直接贴附于鱼肉表面进行检测,无需对样品进行任何前处理。经过多糖修饰的NC膜可以克服鱼肉基质中大分子杂质的干扰,通过微流体聚集效应,在2 min内产生明显的颜色聚集信号。同时,开发了移动端新鲜度检测微信小程序,实现了对样品新鲜度的在线评价,为水产品新鲜度的现场检测提供了支持。本研究建立了基于次黄嘌呤的比色检测体系以及纸基芯片贴体检测体系,比色检测方法突破了现有次黄嘌呤需要多步反应这一关键问题,实现一步加样一步反应即可肉眼或比色观察结果;纸基芯片检测方法克服了水产品表面湿、黏的物理特征和基质组成复杂的生物化学特征,实现了肉眼可视化对鲜度品质的直接判断。检测方法的建立可以满足水产品原料品质的预判断这一重大需求,对于保证水产品原料品质具有重要意义。
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