论文部分内容阅读
背景与目的:结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是常见消化系统恶性肿瘤之一,死亡率高。迄今为止,结直肠癌的确切发病机制尚不清楚,大量文献表明,结直肠癌的发病机制是一个多基因参与的多阶段的过程。膜联蛋白（Annexins,ANX）家族是依赖钙的磷脂结合蛋白超家族,在多种肿瘤的侵袭、迁移以及化疗耐药中扮演着重要作用角色。膜联蛋白A4（Annexin A4,ANXA4,A4）是膜联蛋白家族的一员,大量研究文献证实,Annexin A4在结直肠癌中呈表达明显升高,参与结直肠癌的浸润和转移。我们前期研究发现Annexin A4在CRC组织Ⅰ-Ⅳ期中均表达上调,并在CRC中存在由细胞膜转位至细胞浆的现象,且已有研究证实,在正常细胞中,Annexin A4膜聚集能力受钙离子调节,由此,我们提出科学假设:Annexin A4在结直肠癌细胞中可能存在由细胞膜向细胞浆转位的现象,而该现象可能受Ca2+浓度的影响。本研究可为CRC的发生发展及靶向药物治疗提供重要的理论和实验证据。方法:1.证实Annexin A4在结直肠癌细胞中呈高表达,且其表达水平与结直肠癌患者临床病理特征相关:蛋白质免疫印迹方法检测Annexin A4在正常结直肠细胞和不同结直肠癌细胞系中的表达情况,并通过免疫组化,分析了CRC患者临床病理特征与Annexin A4表达水平的关系。2.验证Annexin A4在结直肠癌中存在表达异常及膜浆转位现象:抽提细胞浆及细胞膜蛋白,通过Western blots免疫印迹、细胞免疫荧光、免疫组化方法检测Annexin A4在正常结肠细胞、结肠癌细胞、结直肠癌组织和癌旁组织中细胞膜及细胞浆中的分布差异。3.在结直肠癌细胞系中通过调节Ca2+浓度改变,观察Annexin A4的膜浆转位情况:用不同浓度的钙离子载体和不同时间分别处理HT-29细胞,观察不同浓度及时间钙离子试剂对Annexin A4表达的影响;将结直肠癌细胞分别用钙离子抑制剂（试验组）、DMSO（对照组）处理,抽膜蛋白和浆蛋白,再检测Annexin A4的表达差异情况。结果:1.在CRC细胞系HT-29中表达明显升高;Annexin A4表达水平与淋巴结及远处转移相关,提示Annexin A4的高表达可促进结直肠癌的侵袭转移。2.Western blots免疫印迹、细胞免疫荧光和免疫组化均显示Annexin A4在正常结肠细胞中呈低表达,主要表达于细胞膜,但在CRC细胞中Annexin A4呈高表达,且主要在细胞浆中高表达。3.用2μM浓度、24小时钙离子载体处理结直肠癌细胞后Annexin A4表达最高,效果最佳;钙离子抑制剂处理过的HT-29细胞,Annexin A4在细胞浆表达较DMSO组表达更高。结论:1.Annexin A4在结直肠癌中呈高表达,且其高表达可促进结直肠癌的侵袭转移。2.在结直肠癌中存在Annexin A4由细胞膜转位至细胞浆,并在细胞浆中出现高表达的现象。3.抑制钙离子活性后结直肠癌细胞中Annexin A4更容易产生细胞浆聚集的现象。