论文部分内容阅读
乳脂是牛奶的主要营养成分之一,能够为人类提供营养和能量,因而生产具有足够乳脂的优质牛奶是健康食品的发展趋势。但是我国牛奶中乳脂的含量普遍偏低,严重降低了乳制品在国内外市场的竞争力,因此提高乳产量及乳脂含量成为我们亟待解决的问题。诱导细胞调亡的DFF45样因子C(Cell-death-inducing DNA-fragmentation-factor-like effector c,CIDEC)是在脂肪细胞中大量表达的一种蛋白质,具有促进能量储备、抑制脂肪分解、诱导大脂滴形成,参与全身能量的平衡与调控的功能。泌乳奶牛乳腺是脂类合成旺盛的场所,但在泌乳奶牛乳腺中,CIDEC的表达以及其在乳脂合成中的作用还不明确。为研究CIDEC的表达与乳脂合成之间的关系,本研究首先通过q RT-PCR、原位杂交、Western bolt和免疫荧光方法分别在转录水平和翻译水平检测了CIDEC在泌乳期高乳品质、泌乳期低乳品质和干奶期奶牛乳腺组织中的表达含量和表达部位变化,结果显示CIDEC在泌乳期高乳品质的乳腺组织中的表达显著高于泌乳期低泌品质和干奶期的奶牛乳腺组织(P<0.05)。CIDEC的表达部位主要位于泌乳乳腺的腺泡上皮细胞这一结果提示CIDEC的表达与乳腺泌乳相关。随后通过基因过表达和干扰的方法,研究了CIDEC基因过表达和干扰后奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯含量的变化,并采用q RT-PCR方法检测了奶牛乳腺上皮细胞中乳脂合成相关基因,包括脂肪酸从头合成、去饱和酶基因(ACC、FASN、SCD)、脂肪酸摄取、转运、活化相关蛋白基因(CD36、FABP3、ACSL1、ACSS2)、TAG合成酶相关基因(GPAT、AGPAT6、DGAT1)、以及乳脂合成转录调控因子(PPARγ、PPARGC1A、SREBP1、INSIG1、SCAP)的表达。结果显示CIDEC基因过表达后,奶牛乳腺上皮细胞中TAG合成量增加、脂滴体积变大、数量增多、乳脂合成相关基因mRNA表达量升高;而CIDEC基因干扰后,奶牛乳腺上皮细胞中TAG合成量减少,细胞内脂滴体积变小,数量减少,乳脂合成相关基因m RNA表达量降低。这些结果表明CIDEC对奶牛乳腺中乳脂合成具有调节作用。为进一步研究泌乳奶牛乳腺中调节CIDEC表达、进而调节乳脂合成的信号通路,我们在奶牛乳腺上皮细胞培养体系中添加8 mmol/L乙酸钠和1 mmol/L BHBA,诱导乳腺上皮细胞中CIDEC的表达和乳脂的合成,并采用Western blot方法研究了mTOR信号通路AMPK信号通路分子的表达。结果显示添加8mmol/L乙酸钠和1 mmol/L BHBA能明显上调m TOR信号通路下游分子4EBP1、p-4EBP1、P70S6K、p-P70S6K的表达;同时还可以诱导细胞中AMPKα的表达上调(P<0.05),降低p AMPK的表达;表明在奶牛乳腺上皮细胞中,CIDEC的表达受mTOR信号通路和AMPK信号通路的调节。为进一步研究奶牛乳腺上皮细胞中CIDEC调节乳脂合成的分子机制,我们采用基因超表达和干扰的方法改变了细胞中PPARγ的表达水平,分析了PPARγ超表达和干扰以后奶牛乳腺上皮细胞中CIDEC表达和甘油三酯含量的变化,并研究了PPARγ过表达同时干扰CIDEC后,乳腺上皮细胞中甘油三酯含量的变化。结果显示PPARγ通过调节CIDEC的表达来调节乳腺上皮细胞中甘油三酯的合成。随后采用双荧光素酶报告基因系统筛选出CIDEC的启动子核心区域在-100—-40bp区段。通过软件分析,预测该位置包含RXRα的结合位点。最后采用Ch IP-PCR技术进一步确定了上游转录因子PPARγ与RXRα相互作用,结合CIDEC启动子,调节CIDEC转录,进而影响乳脂的合成。以上实验研究结果丰富了泌乳奶牛乳腺中乳脂合成的分子机理,可以为人工调控乳质量和乳产量提供实验基础和理论依据。