背景与目的肺癌的发病率排在各种肿瘤的第二位,而死亡率位于第一位,已经成为目前对人类健康威胁最大的恶性肿瘤之一,其中85%是NSCLC (non-small cell lung cancer, NSCLC)。近些年,虽然以铂类为基础的第三代药物的两药联合化疗,分子靶向药物等治疗药物和治疗手段不断发展,但是肺癌患者的五年生存率仍只有15%左右。原因在于85%的NSCLC在诊断时已经处于晚期,肺癌细胞的异常增殖和转移是其中的重要原因之一。因此,人们不断探寻影响肺癌增殖和转移的因素,以期待能控制肺癌的发生发展。研究显示肺癌的增殖和转移受多条信号通路的调控。而蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases, PTPs)和蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases, PTKs)通过对信号通路中的蛋白的去磷酸化和磷酸化作用,维持着蛋白活性的平衡,从而调控信号通路的传导。当PTPs和PTKs有一方出现异常,就会使信号通路紊乱,从而导致包括肿瘤在内的疾病的发生。既往的许多研究集中在PTKs中,发现许多PTKs的过表达或突变会导致肺癌的发生发展。而本研究则集中在PTPs上。蛋白酪氨酸磷酸酶1B (protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B)是PTPs家族的重要成员之一。研究显示PTP1B在代谢性疾病(糖尿病和肥胖)中发挥着重要的作用。而PTP1B在肿瘤中的作用表现为两面性,即在乳腺癌、结肠癌、前列腺癌中可促进肿瘤的进展,在另外一些肿瘤如：食管癌、淋巴瘤等中则作为肿瘤抑制因子。PTP1B在肿瘤中作用的两面性提示PTP1B的作用具有组织特异性。而尚未见PTP1B在NSCLC中作用的研究。PTPlB在NSCLC中的作用如何呢?因此本项目的研究目的如下：1.PTP1B调控NSCLC增殖和转移的作用；2.PTP1B调控NSCLC增殖和转移的机制。材料与方法1.选取NSCLC患者术后病理切片,运用免疫组织化学的方法检测NSCLC组织由PTP1B的表达,并同时检测PTP1B在肺部良性病变中的表达,比较PTP1B在NSCLC组织和良性病变组织中表达的差异。并在NSCLC患者中分析PTP1B的表达与肺癌患者临床病理特征及预后的关系。2.在临床组织标本研究的基础上,通过体外实验进一步证实P1P1B对NSCLC细胞增殖和迁移的调控作用。并研究PTP1B调控NSCLC细胞增殖和迁移的机制。主要分为三个步骤完成。一、在肺癌细胞中转染siRNA-PTP1B,抑制肺癌细胞PTP1B的表达,采用MTT法绘制细胞生长曲线,研究抑制PTP1B表达对NSCLC细胞增殖的影响。并运用划痕实验、Transwell研究抑制PTP1B表达对NSCLC细胞迁移的影响。采用Annexin V/PI双染流式细胞术和PI单染流式细胞术检测PTP1B抑制对NSCLC细胞凋亡和细胞周期的影响。二、用PTP1B过表达的腺病毒载体感染非小细胞肺癌细胞,使肺癌细胞PTP1B过表达,运用MTT法绘制细胞生长曲线,研究P1P1B过表达对非小细胞肺癌增殖的影响。并运用划痕实验、Transwell研究PTP1B过表达对非小细胞肺癌迁移的影响。三、研究PTP1B调节非小细胞肺癌细胞增殖迁移的机制。运用Western-blot分别检测非小细胞肺癌细胞中PTP1B蛋白表达,及上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition, EMT)标志性蛋白(E-Cadherin,N-Cadherin,β-Catenin,Vimentin)表达,研究PTP1B与肺癌细胞EMT的关系；运用Western-blot分别检测非小细胞肺癌细胞中PTP1B表达及p-AKT(ser473)表达,以探讨PTP1B是否通过AKT发挥其作用；运用Western-blot分别检测非小细胞肺癌细胞中PTP1B表达及p-src(Tyr527)表达的变化,以研究PTP1B是否通过src发挥作用,并进一步探讨src下游的蛋白。3.在临床研究和体外细胞实验的基础上,采用动物实验,进一步研究PTP1B在体内对NSCLC增殖的调控作用。选取7周龄雄性裸鼠,分为PTP1B siRNA干扰组和对照组,每组5只裸鼠。处理肺癌细胞后,用PBS制成5×107/mL的肺癌细胞悬液,于裸鼠右前腋下皮下注入0.1 mL的肺癌细胞悬液。定期观察测量肿瘤的最大径和最小径,绘制两组肿瘤的生长曲线。26天后处死裸鼠取出肿瘤,称重,用免疫组化和western-blot法检测PTP1B在肺癌组织中的表达。结果1.通过运用免疫组化对临床组织标本的研究发现,PTP1B的阳性表达主要在肺癌细胞的胞浆呈棕色染色。63例NSCLC组织中有32例阳性表达,而9例肺部良性病变组织均为阴性表达。PTP1B在NSCLC组织中的表达明显高于肺部良性病变(χ2=8.229,P=0.004),提示PTP1B可能在NSCLC细胞的发生发展中发挥一定的作用。PTP1B和肺癌患者临床病理特征间的关系研究表明,PTP1B与NSCLC患者的术后分期相关(χ2=6.426,P=0.040),随着临床分期逐渐增加PTP1B的阳性率也逐渐升高(Ⅰ期35.0%,Ⅱ期42.1%,ⅢⅢ期70.8%)。Kaplan-Meire生存分析显示PTP1B表达阴性的患者总生存明显好于PTP1B表达阳性的NSCLC患者(Log-rank test P=0.047),并且COX多因素回归分析显示PTP1B阳性表达提示患者的不良预后(HR=2.050,95%CI:1.020-4.118)。 PTP1B阳性的NSCLC患者死亡风险比PTP1B阴性患者高一倍。2.在体外细胞实验中,siRNA抑制PTP1B表达后,PC9细胞的增殖能力明显下降,并且划痕实验和Transwell均表明抑制PTP1B表达可明显降低肺癌细胞的迁移能力。流式细胞检测发现抑制PTP1B的表达,可促进肺癌细胞的凋亡,提示抑制PTP1B表达抑制肺癌细胞的增殖和迁移,可能部分通过促进细胞凋亡完成。但流式细胞检测也发现抑制PTP1B的表达并不能影响肺癌细胞的细胞周期。用PTP1B的腺病毒过表达载体感染使肺癌细胞的PTP1B过表达可以增加肺癌细胞的增殖和迁移能力。接着探索PTP1B调控NSCLC细胞增殖和迁移的机制。首先运用Western-blot检测NSCLC细胞PTP1B对上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition, EMT)标志性蛋白(E-Cadherin,N-Cadherin, β-Catenin,Vimentin)表达的影响,结果显示不论PTP1B抑制或过表达均没有明显影响E-Cadherin, N-Cadherin,β-Catenin, Vimentin的表达,提示PTP1B调控肺癌细胞的迁移与EMT无明显相关。然后运用Western-blot检测NSCLC细胞PTP1B的表达对p-AKT(ser473)影响,结果表明不论PTP1B抑制或过表达均没有明显影响p-AKT(ser473)的表达,显示PTP1B的表达不能影响AKT的磷酸化水平。最后Western- blot检测发现,在NSCLC细胞中,PTP1B过表达可以降低p-src (Tyr527),从而激活src,并且src激活增加下游ERK1/2的磷酸化水平,激活ERK1/2。但抑制PTP1B和在HBE细胞中PTP1B对src无明显影响。提示抑制PTP1B的表达可能通过其他途径抑制肺癌细胞的增殖和迁移,同时PTP1B在肺癌细胞和正常支气管上皮细胞中的作用不同。3.通过动物实验,在体内进一步研究PTP1B对NSCLC细胞增殖的调控作用。研究结果显示P1P1B抑制组的裸鼠肿瘤的大小和重量明显小于正常对照组(P=0.0488),提示抑制PTP1B的表达在体内环境仍可以抑制肺癌细胞的增殖。针对肿瘤组织的检测发现。有两例siRNA干扰组的肺癌组织PTP1B表达低于正常对照组,并且siRNA干扰组内的肺癌组织PTP1B的表达也不同,提示P1P1B的表达还受到体内环境的影响。结论与意义1.本研究首次探讨PTP1B在NSCLC增殖和转移中的作用。本项目从临床标本、体外细胞实验和动物实验证实PTP1B可以促进NSCLC增殖和转移,并且PTP1B在肺癌组织中的高表达与患者的不良预后相关。2.初步证实PTP1B促进NSCLC增殖和转移与PTP1B增加细胞凋亡,使src Tyr527去磷酸化激活src进而激活下游的ERK1/2有关。而与细胞周期无明显相关。3. PTP1B小分子抑制剂研究火热,为其将来有可能应用在NSCLC治疗中提供了一定的理论基础