论文部分内容阅读
植物在其生境中不可避免地遭受到高温、低温、干旱等非生物逆境及病原菌侵染和昆虫取食等生物逆境而影响其生长发育。相应地,植物通过长期的进化也形成了复杂有效的抗逆机制来减少各种逆境对其生长发育的不利影响。这些机制包括对胁迫的感知、信号转导、基因表达的调节及相应的代谢、生理和形态调节等。基因表达的调节是其中的关键环节,分离和剖析这些基因的表达和调控机制及其在植物适应逆境中的作用及其机制,对于阐明植物抗逆机制,促进植物抗逆的有效遗传改良具有十分重要的意义。辣椒(Capsicum annuum L.)是我国及世界上十分重要的茄科蔬菜和工业加工原料作物,辣椒生产具有效益高,但其土传病害多、病害和各种逆境危害严重因而风险也较高的特点,培育抗逆品种解决辣椒抗逆、确保辣椒生产的产量、品质和效益,促进辣椒可持续发展的根本技术对策,而辣椒抗逆分子机制的阐明则是实现生物技术与常规育种相结合,促进辣椒抗逆有效遗传改良的重要基础研究。鉴于此,本研究开展了辣椒AP2/ERF类转录因子、脂质转移蛋白和Arf-GAPs基因等辣椒防御反应相关基因的全长cDNA的分离,并对AP2/ERF类转录因子表达、功能进行了初步研究,主要结果如下:1、从辣椒cDNA文库中分离获得了CaERF14、CaDREB3、CaAGD8和CaLTP1等4个基因的阳性cDNA克隆,其长度分别为1572bp、1997bp、1938bp和1211bp,分别含有编码283、357、408和129个氨基酸的开放读码框。CaERF14和CaDREB3的cDNA推导的氨基酸序列都含有ERF亚族的AP2/ERF保守结构域。同源性比对及分子进化树分析表明CaERF14属于ERF亚族的Ⅹa(B-4)亚组,CaDREB3属于ERF亚族的Ⅰb(A-6)亚组,CaAGD8含有一个ARF-GAP结构域,而CaLTP1含有一个保守的AAI结构域,属于LTP家族的第Ⅰ类非特异性脂质转移蛋白。用35::CaERF14-GFP瞬间表达载体通过基因枪轰击洋葱表皮,发现35::CaERF14-GFP融合蛋白定位于细胞核和细胞膜,35:: CaDREB3-GFP融合蛋白定位于细胞核。瞬时表达结果表明CaERF14和CaDREB3都可以和GCC-box结合而不结合DRE/CRT元件。2、荧光定量分析基因表达结果表明,外源水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯利(ETH)和脱落酸(ABA)及干旱、盐胁迫处理和青枯菌病原菌接种均可以诱导CaERF14上调,而不受外源生长素(auxin)、高温和低温胁迫处理诱导; CaDREB3基因在外源SA、MeJA、ETH和青枯菌病原菌接种、低温胁迫下上调,而不受外源ABA和auxin及干旱、高盐和高温等逆境胁迫诱导, CaDREB3基因在机械损伤胁迫后6h有微量的上调,其余时段都为下调表达。3、利用2个超表达转基因T1代株系的植株,研究上述两个基因超表达对表型的影响,结果发现CaERF14的超表达使转基因株系的烟草种子发芽及幼苗生长对模拟脱水逆境及盐胁迫的耐受力有所提高,表现出在上述逆境下较野生型对照高的植株鲜重、叶绿素和脯氨酸含量以及较高的SOD、POD酶活性。而青枯菌接种试验中,在CaERF14超表达转基因株系与和野生型对照中未发现明显差异。在盐胁迫下,CaDREB3超表达株系比野生型烟草表现出更高的种子发芽率、更低的植株鲜重、叶绿素含量、脯氨酸含量及SOD、CAT和POD酶活性。青枯病病原菌接种发现,CaDREB3超表达转基因烟草植株表现出较野生型对照更强的抗性。4、进一步通过荧光定量PCR分析表明, CaERF14的超表达可显著增强NtERD10a、NtERD10b、NtERD10d、NtCA、NtSOD、NtTsip1等干旱及盐相关基因的转录水平,却降低病程相关基因的转录表达水平; CaDREB3的超表达却可显著增强NtPR1、NtPR2、NtPR3、NtPR4等病程相关基因的转录水平。综上所述,经分析表明,CaERF14参与了一系列防御反应相关基因的表达,并介导了转基因烟草对高盐及干旱的抗性。ABA胁迫诱导CaERF14的表达,推定CaERF14基因可能是依赖于ABA途径应答非生物胁迫;CaDERB3参与了病程相关基因(PR)的表达,转基因CaDREB3烟草表现出对盐的敏感及抗青枯病,而ET、SA和JA对CaDREB3的诱导表达,推定CaDREB3基因可能参与了ET,或SA/JA的信号途径;生物信息学及组织特异性分析表明CaAGD8和CaLTP1可能参与应答植物生物及非生物胁迫。