microRNA(miRNA)在哺乳动物的黑素生成和毛发颜色的调节中起重要作用。短串联标靶模拟(STTM)技术已被用于有效阻碍植物和动物中microRNA的功能。我们先前研究表明,miR508-3p通过直接靶向小眼畸形相关转录因子(MITF)在调节羊驼黑素细胞的黑素生成中发挥功能性作用。为了验证miR508-3p功能对羊驼黑素细胞黑素生成的影响,在本研究中使用STTM技术阻碍miR508-3p的表达,通过生物信息学分析,靶基因验证,运用双荧光报告试验,荧光定量PCR试验,蛋白免疫印迹试验,细胞免疫化学试验,从而验证了miR508-3p功能对羊驼黑素细胞黑素生成的影响。试验内容和结果如下:1.运用miRBase和TargetScan靶基因生物信息学分析发现miR508-3p的靶向基因之一为SOX6,经SOX6的3’UTR双荧光报告载体和STTM-miR508-3p过表达载体在293T细胞中共表达后,双荧光素的活性是对照组的1.38倍。因此,推测SOX6是miR508-3p的一个靶向基因。2.在羊驼黑色素细胞中,过表达STTM-miR508-3p后,经qRT-PCR方法检测miR508-3p的mRNA变化。实验结果显示,STTM-miR508-3p过表达下调miR508-3p mRNA的表达,具有明显的抑制效果。3.在羊驼黑色素细胞中,过表达STTM-miR508-3p后,经qRT-PCR、western blotting和细胞免疫化学试验方法检测靶基因SOX6,下游基因Cyclin D1,主要色素调控基因CREB、MITF、TYR、TYRP1、TYRP2的mRNA,蛋白水平的变化以及靶基因SOX6在羊驼黑色素细胞中的定位。实验结果显示,STTM-miR508-3p过表达上调SOX6、Cyclin D1、CREB、MITF、TYR、TYRP1、TYRP2基因mRNA表达和蛋白水平;在羊驼黑色素细胞中靶基因SOX6阳性反应主要分布在胞质内。4.在羊驼黑色素细胞中,过表达STTM-miR508-3p后,检测黑色素细胞的黑色素含量、褐黑素含量和真黑色素含量。实验结果显示,STTM-miR508-3p过表达引起总黑色素含量、褐黑素含量和真黑色素含量明显上调。Fontana-Masson染色发现,过表达STTM-miR508-3p后黑色素细胞内黑色素颗粒明显增多。结论:STTM-miR508-3p通过靶向结合SOX6调控下游基因Cyclin D1,从而调控毛色相关基因CREB,MITF,TYR,TYRP1和TYRP2表达而影响黑色素含量的变化。