肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)是由汉坦病毒(Hantavirus,HTV)引起,由鼠类等传播的自然疫源性疾病,主要临床特征为发热、出血、肾脏损害,病死率高。我国是世界上肾综合征出血热疫情最严重的国家,年发病人数在2-5万左右,且新疫区不断出现,并时有暴发流行。临床上目前尚缺乏特异有效的治疗药物,因此,HFRS严重威胁着人类的健康。目前我国已经成功研制出三类出血热灭活疫苗,包括乳鼠脑纯化灭活疫苗(HTN型)、细胞培养灭活单价疫苗(沙鼠肾细胞HTN型疫苗、地鼠肾细胞SEO型疫苗)和双价疫苗(HTN型和SEO型)。虽然灭活疫苗的研制成功对预防HFRS的发生和流行起到了积极作用,但通过使用发现该类疫苗仍存在一些问题:主要是其不能有效地刺激细胞免疫应答,此外诱导机体产生中和抗体的能力也较弱,抗体滴度不高。因此研制更为有效的疫苗是预防HFRS发生和流行急需解决的问题。HFRS的病原体为汉坦病毒,属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae),汉坦病毒属(Hantavirus),是一类有包膜分节段的单负链RNA病毒,基因组包括L、M、S 3个片段,分别编码RNA聚合酶、包膜糖蛋白(glycoprotein, GP)G1和G2、核衣壳蛋白(nucleocapsid, NP)。M基因编码的GP可诱导机体产生特异性中和抗体,且中和抗原位点主要位于G2糖蛋白上。S基因编码的NP上亦分布有多个抗原表位,此外,NP还可诱导机体产生强烈的细胞免疫反应,参与机体对病毒的清除。研究表明GP的免疫原性较弱,诱导产生的抗体出现较晚且滴度不高。而NP是汉坦病毒结构蛋白中免疫原性最强的,其刺激机体产生的抗体出现早,滴度高,且可诱导机体产生免疫保护。因此将二者融合表达,有望达到优势互补的目的。在之前的研究中,我们将M基因与S基因的0.7Kb片段进行了融合表达,用嵌合基因免疫小鼠,可刺激小鼠同时产生针对病毒的特异性体液免疫和细胞免疫反应。然而在研究中我们也发现了一些问题,如尽管利用各种系统均能表达出完整的融合蛋白,但总的来说蛋白表达量还是偏低。此外,免疫小鼠后虽然各表达系统均能刺激机体产生体液及细胞免疫应答,且腺病毒表达系统的效果要优于其他系统,但是整体的免疫水平还不十分理想。因此,进一步选择合适的表达载体、优化表达系统并使抗原分子更为有效的递呈,以提高嵌合基因的表达量及其刺激机体免疫应答的能力,是目前HFRS基因工程疫苗研究中急需解决的问题。之前,我们已经将腺病毒表达系统的转录调控结构进行了优化,即引入CAG启动子与WPRE转录后调控序列。实验发现,使用CAG后,腺病毒中嵌合基因的表达水平提高两倍左右且高于单独或同时使用WPRE组。本课题拟在前期已优化转录调控结构的基础上,联合应用抗原加工递呈分子基因HSP70C(热休克蛋白70氨基端片段编码基因)与Ub基因,以进一步提高嵌合基因表达抗原的加工和提呈,特别是进一步提高刺激体液以及细胞免疫应答的能力。1.转移载体的构建依据Genbank序列,设计引物,PCR扩增得到HSP70C基因和Ub基因并分别克隆入T easy载体测序验证其正确性。随后将HSP70C和Ub分别插入pShuttle-G1S0.7-CAG.、pShuttle-G2S0.7-CAG中,重组的转移载体经限制性内切酶消化后,琼脂糖凝胶电泳分析,阳性克隆命名为pShuttle-G1S0.7-CAG-HSP70C、pShuttle-G2S0.7-HSP70C、pShuttle-G1S0.7- CAG-Ub、pShuttle-G1S0.7-CAG-Ub。2.重组腺病毒DNA的构建将重组的转移载体用PI-SceⅠ和I-CeuⅠ酶切后与Adeno-XTM Viral DNA连接,利用PCR鉴定重组的腺病毒DNA。3.重组腺病毒的包装及鉴定将含目的片段的重组腺病毒DNA转化大肠杆菌进行大量扩增纯化,并测定浓度。利用PacⅠ线性化重组腺病毒DNA后转染HEK293细胞。观察细胞的CPE现象,通过反复冻融裂解细胞获得病毒原种。取病毒原种加入感染HEK293细胞,获得病毒初次扩增产物,并用PCR法鉴定重组腺病毒。4.重组腺病毒的纯化与滴度测定用病毒初次扩增产物感染单层HEK293细胞,将琼脂糖凝胶与DMED混合物覆盖其上,进行噬斑实验。待出现噬斑后,挑取单斑获得纯病毒。从单层细胞的一个单斑中获得病毒并扩大培养。利用终点稀释法测病毒的滴度,纯化后的重组腺病毒滴度达109pfu/mL。5.重组腺病毒表达产物的鉴定以100 pfu/cell的MOI感染HEK293细胞,在24-48 h检测细胞中蛋白的表达。免疫荧光结果表明,重组腺病毒感染的HEK293细胞均可被抗汉坦病毒NP的特异性mAb1A8所识别。重组腺病毒Ad-G1S0.7-CAG-HSP70C及Ad-G2S0.7-CAG-HSP70C感染的HEK293细胞可被HSP70的特异性抗体识别,重组腺病毒Ad-G1S0.7-CAG-Ub及Ad-G2S0.7-CAG-Ub感染的HEK293细胞可被Ub的特异性抗体识别。