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糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病特有且常见的眼部并发症,是导致糖尿病患者视力损害、视网膜剥脱和致盲的重要原因。以往观点认为DR只是一种糖尿病微血管并发症,然而,近年来研究发现,DR病变过程中除微血管病变外,还存在着神经退行性病变,甚至神经性病变早于微血管病变。其中视锥细胞作为视网膜重要的光感受器细胞,主司明视觉,视网膜色素上皮细胞作为视网膜血-视屏障的重要构成部分,具有支持和营养光感受器的作用,维护视觉和视网膜功能中发挥着重要作用,可能成为糖尿病早期侵袭的细胞之一。因此,开展高糖诱导视锥细胞及视网膜色素上皮细胞损伤的发生机制研究以及以此为靶点的治疗药物研发对于防治DR具有重要意义。已有研究显示,DR的发病机制与视网膜及视网膜支撑细胞的自噬-凋亡失衡密切相关,其中AMPK作为能量代谢开关,通过抑制mTOR,发挥上调自噬的作用,提出AMPK/mTOR信号通路作为调控自噬-凋亡平衡的一条重要信号通路在DR的发生发展过程中发挥着关键作用。调控该通路的药物可能发挥保护视网膜神经退行性病变的作用。黄连素,又称盐酸小檗碱(Berberine,BBR),是黄连的主要活性成分,临床上主要用于治疗胃肠道疾病。近年来研究发现黄连素可作为AMPK激动剂,用于防治Ⅱ型糖尿病及其并发症。本课题组前期研究发现,以黄连素为主要活性成分的黄癸固体分散体(Huang-gui solid dispersion,HGSD)能够使AMPK/mTOR通路激活,增加Müller细胞的自噬,减少Müller细胞的凋亡,从而达到改善DR的作用[3]。然而关于黄连素是否可以通过调节AMPK/mTOR信号通路,激活视锥细胞和视网膜色素上皮细胞自噬,减少细胞凋亡,改善高糖诱导视锥细胞细胞和视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用机制目前尚有待验证。本课题拟建立高糖诱导的视锥细胞和视网膜色素上皮细胞损伤模型,给予AMPK抑制剂siRNA和激动剂AICAR,验证高糖损伤视锥细胞和视网膜色素上皮细胞中AMPK活性下调,诱导细胞自噬-凋亡失衡的发病机制;明确黄连素通过调节AMPK/mTOR信号通路,促进细胞自噬,减少细胞凋亡,改善高糖诱导的视锥细胞和视网膜色素上皮细胞损伤作用机制。本论文的研究内容如下:Ⅰ.探讨AMPK/mTOR通路异常在高糖诱导视锥细胞和视网膜色素上皮细胞损伤中的作用。通过高糖诱导建立视锥细胞和色素上皮细胞损伤模型(HG组),并给予AMPK抑制剂siRNA或激动剂AICAR干预。Hoechst 33258染色检测细胞凋亡,MDC染色方法检测细胞自噬;Western Blot的方法检测AMPK/mTOR信号通路相关蛋白p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR,凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3,以及自噬相关蛋白Beclin-1、LC3I/II及ULK1表达。与Con相比,HG组细胞核凝集固缩、边缘不规则,凋亡细胞增加;MDC染色显示黄绿色荧光颗粒减少,自噬减弱;细胞抗凋亡蛋白Bcl-2明显减少,Caspase-3和促凋亡蛋白Bax表达显著增加,自噬相关蛋白Beclin-1、LC3I/II及ULK1的表达明显减少,p-AMPK/AMPK表达减少、p-mTOR/mTOR表达增加。给予siRNA敲降视锥细胞和色素上皮细胞AMPK表达,细胞自噬及凋亡水平及其蛋白表达与HG处理后相当,而给予AMPK激动剂AICAR,自噬增多,凋亡细胞数减少,逆转高糖对细胞凋亡相关蛋白及自噬相关蛋白的影响。结果表明高糖通过抑制视锥细胞和色素上皮细胞AMPK表达及活性,增加mTOR表达,减少细胞自噬,诱导细胞凋亡的发病机制。Ⅱ.明确黄连素通过调节AMPK/mTOR通路改善高糖诱导的视锥细胞和视网膜色素上皮细胞损伤。在高糖诱导视锥细胞和色素上皮细胞损伤模型基础上,给予黄连素(BBR组),或联合AMPK抑制剂siRNA干预,检测上述指标,结果表明,与HG组相比,BBR组细胞核形态明显改善,核固缩减少,细胞核呈弥散性的均匀的淡蓝色;MDC染色结果显示黄绿色荧光颗粒明显增多;抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平显著升高,而Caspase-3和促凋亡蛋白Bax表达明显降低,自噬相关蛋白Beclin-1、LC3I/II及ULK1表达增加,p-AMPK蛋白表达增加;p-mTOR蛋白表达减少。而联合AMPKsiRNA干预后阻断了黄连素促进自噬抑制凋亡的作用。结果表明,黄连素通过激活AMPK信号通路,促进细胞自噬,减少细胞凋亡。发挥保护高糖诱导的视锥细胞和视网膜色素上皮细胞受损的作用。综上,AMPK/mTOR通路异常在高糖诱导视锥细胞和色素上皮细胞损伤中起到重要作用,黄连素通过调节AMPK/mTOR通路,促进自噬,抑制细胞凋亡,改善高糖诱导视锥细胞和色素上皮细胞受损。