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研究背景慢性痛并非是一种独立的病理生理状态,世界卫生组织于2000年提出“慢性痛是一类疾病”;2018年,世界卫生组织首次将“慢性痛”收录为疾病编码,慢性痛作为一类疾病进行系统分类。长期的疼痛导致机体处于恶性应激状态,常常提示人体机能下降或组织器官出现健康威胁。由此引起相关衍生疾病、镇痛药物的副作用等诸多问题。目前,全球成人慢性痛的发病率已经逼近30%,意味着每10个成人中,平均有3个被慢性痛困扰。如何有效控制疼痛、预防药物滥用等问题具有广泛的现实意义和重要的临床价值。然而,慢性痛状态对远隔器官(如心脏)的功能的影响是值得重视的问题。流行病学调查研究明确证实慢性痛患者心血管病发病率明显升高且预后更差,相关的病理生理学机制并不明确。目前较为常用的镇痛药物也存在心血管毒副作用,例如,非甾体类抗炎药用于镇痛的同时会增加心血管事件的发病率,严重限制了药物的临床应用。因此,找寻慢性痛状态下相关的心血管事件发生发展的机制以及有效的防治办法,成为亟待解决的重要问题。心肌缺血再灌注损伤是重大的临床医学问题,改善心肌抗缺血损伤能力是临床治疗的重要方向。有临床数据显示:慢性痛显著升高缺血性心肌病的患者死亡率,提示慢性痛可能导致心肌出现缺血易损。因此,本课题旨在探讨:慢性痛导致心肌缺血易损的生物学机制。本课题组前期的相关研究证实,在脊髓背根节压迫模拟慢性病理性神经痛模型中,由脂质过氧化产生的活性醛类物质(如,4HNE)在组织细胞中累积并影响蛋白质活性,引发羰基应激。慢性病理性神经痛引发的羰基应激可导致心肌在遭受缺血/再灌注时,损伤明显加重,心肌细胞死亡增加。随之而来的问题是,有必要对慢性痛导致心肌缺血易损过程中心肌细胞的死亡方式进行深入探讨。程序性坏死(Necroptosis)作为一种可调控的细胞坏死形式,在心肌缺血/再灌注损伤中的作用日益受到重视。已经证实,Necroptosis受到RIP1、RIP3蛋白形成坏死复合物(necrosome)并激活下游MLKL等信号级联活化通路调控。能否针对Necroptosis探寻慢性痛相关心肌缺血易损的防治措施是心肌保护的新策略。目的本课题在前期研究基础上,重点探讨:1.慢性痛状态对心肌缺血再灌注损伤的影响。2.分析心肌细胞程序性坏死在慢性痛相关心肌缺血易损中的作用。3.明确慢性痛状态下在血浆及心肌组织中TNF-α水平,并分析其下游RIP1-RIP3-MLKL以及RIP3-CaMKII相关信号机制。4.明确外源性褪黑素(Melatonin)能否通过降低TNF-α在血浆及心肌组织中水平,抑制其下游RIP1-RIP3-MLKL以及RIP3-CaMKII信号通路,进而减少氧化应激及心肌细胞程序性坏死,从而实现减轻疼痛和心肌保护。方法1.本实验研究以成年C57小鼠为实验研究对象,采用经典的小鼠选择性神经损伤模型(spared nerve injury,SNI)建立慢性病理性神经痛模型(SNI组),以假手术组(Con组)为对照。部分实验中采用C57背景来源的成年RIP3敲除(RIP3 KO)小鼠建立SNI模型,以成年野生型(WT)C57小鼠为实验对照。2.采用经典的机械刺激缩足阈值法(Von Frey filament)进行小鼠疼痛行为学测定。3.SNI术后4周后,建立小鼠在体心肌缺血再灌注模型,缺血30分钟,再灌注4小时。4.采用超声心动图评估小鼠心脏收缩舒张功能;定量检测循环水平LDH;TTC染色检测心肌梗死面积;EBD染色检测心肌细胞坏死程度,全面评估MI/R损伤程度。5.定量检测血浆TNF-α水平;免疫组织化学染色检测心肌组织中TNF-α。6.采用蛋白免疫印迹法检测心肌RIP1,RIP3,MLKL,磷酸化MLKL,CaMKII,磷酸化CaMKII水平;免疫共沉淀法检测RIP1-RIP3相互作用。结果1.慢性疼痛导致心肌缺血易损加重建立SNI小鼠模型后,采用Von Frey filament机械刺激检测其损伤一侧的后爪回缩机械阈值(ipsilateral hind paw withdrawal mechanical threshold,PWMT)。与SNI术前相比,术后PWMT明显降低且维持4周以上,表明慢性病理性神经痛模型成功建立。SNI术后4周,对SNI-WT组和Con-WT组小鼠建立在体心肌缺血再灌注损伤(MI/R)模型(缺血30分钟/再灌注4小时)。实验发现,与对照组相比,SNI慢性痛小鼠心肌损伤明显加重,表现为:心肌梗死面积增加;MI/R后血浆LDH水平升高;左心室射血分数(EF%)和左心室短轴缩短率(FS%)明显减退;MI/R后死亡率明显升高。以上结果均提示,SNI诱发的慢性痛可加重MI/R损伤,导致心肌缺血易损。2.慢性痛小鼠MI/R后心肌细胞程序性坏死加重采用EBD染色发现:与对照组小鼠相比,SNI小鼠MI/R后心肌细胞坏死程度更为严重。这一结果提示,心肌细胞程序性坏死可能是导致慢性痛小鼠心肌缺血易损的重要因素。进而检测循环水平TNF-α含量发现,与对照组小鼠相比SNI-慢性痛小鼠血浆中TNF-α在MI/R之后显著升高。再灌注4小时后,心肌免疫组织化学染色结果也提示慢性痛小鼠心肌组织中TNF-α增高显著。并且,通过WB实验发现,SNI慢性痛小鼠心肌中RIP1与RIP3水平明显上升(与Con组相比,P<0.05,n=5);通过Co-IP实验进一步发现,慢性痛小鼠MI/R心肌中RIP1-RIP3结合程度(即necrosome坏死小体)较对照组显著升高。以上信号机制的结果表明,心肌细胞程序性坏死是慢性痛小鼠心肌缺血易损的重要组成部分。慢性痛导致的TNF-α升高可能是触发心肌细胞程序性坏死的因素。3.RIP3敲除抑制细胞程序性坏死为进一步明确Necrosptosis的作用,实验进一步采用RIP3-KO小鼠建立SNI慢性病理性神经痛模型(SNI-RIP3 KO组),以慢性痛WT小鼠(SNI-WT组)为对照,并给予MI/R损伤。分析心肌Necrosptosis相关信号表达发现:与SNI-WT组小鼠相比,SNI-RIP3 KO组心肌MLKL磷酸化水平、CaMKII磷酸化水平明显降低。DHE探针检测ROS生成,提示SNI-RIP3 KO组ROS产生明显下降(与SNI-WT相比,P<0.05,n=5),EBD染色提示心肌细胞程序性坏死降低(与SNI-WT相比,P<0.05,n=5)。上述结果进一步证实:RIP1/3-MLKL/CaMKII介导的心肌程序性坏死参与慢性痛小鼠心肌缺血易损;针对性抑制上述信号通路可有效缓解慢性痛小鼠心肌MI/R损伤。4.Melatonin抑制慢性痛小鼠心肌细胞程序性坏死Melatonin是松果体分泌的胺类激素,具有镇痛和心脏保护作用。在进一步探寻抑制心肌程序性坏死的实验中,外源性给予SNI小鼠20,40,60 mg/kg不同剂量褪黑素腹腔注射治疗后发现:低浓度(20,40 mg/kg)褪黑素并不能明显改善SNI小鼠痛觉反应;60 mg/kg高浓度褪黑素才可显著提高PWMT,有效提高痛阈,表明Melatonin具有一定的镇痛效果。但是我们发现,在再灌注前10 min给予20 mg/kg Melatonin可有效降低SNI小鼠心肌组织和血浆中的TNF-α;抑制心肌降低RIP1/RIP3相互作用,抑制necrosome形成;降低其下游MLKL以及CaMKII磷酸化水平和MI/R心肌ROS生成;EBD染色发现Melatonin处理有效的降低了慢性痛小鼠MI/R后心肌细胞程序性坏死。5.Melatonin改善慢性痛小鼠心肌缺血易损在整体动物实验中证实:Melatonin处理可有效减轻SNI小鼠MI/R损伤:减小心肌梗死面积;降低LDH水平;改善MI/R后心脏收缩舒张功能;最终,明显提高SNI小鼠MI/R损伤后的生存率。结论1.慢性病理性神经痛可诱发心肌缺血易损。2.心肌细胞程序性坏死是慢性病理性神经痛诱发心肌缺血易损过程中重要的心肌死亡方式。其中,慢性痛导致的TNF-α升高可能是加重MI/R心肌细胞程序性坏死的因素。3.心肌RIP1-RIP3相互作用及其下游MLKL/CaMKII信号通路是慢性痛小鼠MI/R心肌程序性坏死的重要调控机制。4.给予外源性褪黑素可抑制TNF-α和RIP1/RP3-MLKL/CaMKII信号通路,抑制MI/R心肌细胞程序性坏死。5.褪黑素改善慢性痛导致的心肌缺血易损,并且具有一定的镇痛效果。本研究证实了慢性痛作为恶性的基础因素可导致心肌在遭受缺血再灌注损伤时出现程序性坏死,表现为缺血易损。本研究提出了慢性痛相关的心肌保护策略是值得关注的新领域。本研究采用褪黑素抑制心肌细胞程序性坏死的研究来探讨在心肌保护的同时兼顾一定的镇痛效果的心肌保护方案,可为临床疼痛患者提供器官保护方案以及防治慢性痛相关心血管并发症提供新的实验依据。