黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)引起的番茄病毒病十分普遍和严重,已经成为影响番茄产量和品质的最主要病害之一。在我国,每年CMV造成的番茄产量损失占总产量的15%以上,经济损失可达数十亿元人民币。到现在为止,还没有出现防御CMV侵染,减少产量损失的有效策略。由于缺乏天然的植物抗CMV基因,常规育种方法不能满足生产上的需要。近几年植物基因工程和分子生物学的快速发展,为植物抗病育种开辟了新途径。核酶技术是近年来发展的高新生物技术之一。核酶(ribozyme)是一类具有类似于蛋白质酶催化功能的RNA分子,能够在分子内切割RNA特定序列的磷酸二脂键。核酶可以切割RNA病毒的核酸,达到抗病毒目的,被用于植物抗病毒研究中; 基因沉默(gene silencing)机制是近几年来分子生物学中的研究热点。基因沉默是原始真核生物就具有的一种古老的病毒防御体系。除了可以防御病毒,还可以保护植物基因组免受转座子和转基因等外源基因的入侵; 反义RNA技术用在转基因植物中,能抑制植物基因的表达和病毒的复制。我们利用基因转化方法,对核酶、基因沉默和反义RNA技术在抗病中的应用进行探讨。本研究的主要结果有如下几点: CMV华北地区流行株系外壳蛋白(coat protein,CP)基因的克隆:从河北番茄生产地块采集有典型症状的发病叶片,经酶联免疫法(DAS-ELISA)测定,证实有CMV的存在,将此株系编号为988LJ。用RT-PCR法克隆了1049bp长的CMV-CP基因的cDNA序列,包括657bp的编码区,所编码蛋白的氨基酸残基数为218。经序列分析比较,与已报道的其他CMV株系有很高的同源性。核酶基因、反义及正义CP基因三个植物表达载体的构建:选择988LJ株系CP基因序列上的四个位点,设计合成了有四个催化区域,抗CMV的锤头型核酶基因(4rz)构件,并转化到载体中,得到了核酶基因表达载体。同时将CP基因中与核酶区域相同,但不包括催化区的部分序列反向和正向插入到载体中,得到反义(as)和正义(se)基因表达载体。转化三种植物表达载体的番茄再生植株的获得:通过农杆菌转化法对三个番茄栽培品种进行转化,各个载体和品种都获得了大量的转基因植株。对导入的核酶基因及反义、正义CP基因片段,标记基因新霉素磷酸转移酶基因nptII进行