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研究背景炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）是一种病因不明的慢性非特异性肠道炎性疾病,主要包括克罗恩病（Crohn’s disease,CD）及溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）。近年来,我国儿童IBD的患者数量逐渐增加,已成为临床的常见疾病之一,但其发病机制尚不完全明了。目前的治疗方案未能从根本上解决药物治疗无效及并发症的问题,高额的治疗费也给家庭和社会带来沉重的经济和医疗负担。因此,研究IBD的发病机制,为IBD的治疗寻找新的靶点具有重要的现实意义。自噬是细胞在应激条件下发生的一种分解自身成分的代谢过程,以防止细胞损伤并促进生存,对维持细胞及机体的稳态具有重要作用。研究发现自噬参与IBD的发病过程,肠黏膜杯状细胞通过自噬调节黏液的合成和分泌,维持肠屏障功能。然而,在IBD发生发展中,肠黏膜杯状细胞的自噬作用是否参与IBD损伤修复及其调控机制尚有待研究。文献报道IBD患儿结肠颗粒酶A（Granzyme A,GZMA）表达下调,UC患者结肠GZMA表达水平与临床缓解及黏膜愈合呈正相关。课题组前期研究发现IBD患儿结肠黏膜CD8+CD39+T细胞高表达GZMA,杯状细胞高表达机械敏感离子通道1（PIEZO1）。PIEZO1通过Erk/Ca2+及ROCK1/2信号调控杯状细胞黏蛋白2（MUC2）及紧密连接蛋白Claudin-1的生成,以维持肠上皮屏障功能。因此,我们推测:IBD患儿结肠黏膜CD8+CD39+T细胞高表达GZMA,通过PIEZO1途径调控肠上皮细胞自噬,促进紧密连接蛋白的生成,维持肠上皮屏障功能。研究目的通过临床样本和体外实验,阐述肠黏膜表达GZMA,通过PIEZO1途径调控肠上皮细胞自噬,增加紧密连接蛋白产生,维持肠上皮屏障功能的作用和机制,为IBD的治疗寻找新的靶点。研究方法1、2019年6月1日至2020年12月31日于广州市妇女儿童医疗中心消化科住院治疗,排除肠道细菌、病毒、寄生虫感染,结核病和恶性肿瘤,内镜和病理学检查诊断为IBD的患儿为实验组;内镜以及病理学检查结果正常,或单个结直肠幼年息肉的患儿为对照组。经监护人签署知情同意书。2、收集IBD患儿及对照组儿童的临床资料、外周血和肠黏膜组织样本。酶联免疫吸附试验检测外周血和黏膜GZMA的表达水平;透射电镜观察肠黏膜中自噬小体表达;免疫荧光检测肠黏膜CD8、GZMA及自噬相关蛋白LC3表达;免疫荧光共定位检测结肠上皮细胞标记蛋白E-cadherin及自噬相关蛋白LC3表达。3、选择HT-29细胞和Ca CO2细胞,无血清饥饿24h后加入GZMA（500nmol/L）培养6h,免疫印迹法检测自噬相关蛋白表达;使用m RFP-GFP-LC3质粒转染肠上皮细胞,加入GZMA（500nmol/L）培养6h,荧光显微镜下观察细胞自噬流变化。4、使用慢病毒sh-PIEZO1及对照组慢病毒sh-CTL感染Ca CO2及HT-29细胞构建稳定表达株,使用免疫印迹法检测稳定表达株细胞自噬相关蛋白表达水平;将稳定表达株细胞无血清饥饿24h,加入GZMA（500nmol/L）培养6h,免疫印迹实验及q PCR检测自噬相关蛋白表达水平。5、选择HT-29细胞和Ca CO2细胞,细胞无血清饥饿6h,加入GZMA（500nmol/L）及自噬激动剂雷帕霉素培养48h,免疫荧光检测ZO-1表达。6、使用免疫印迹实验检测稳定表达株NF-κB p65表达水平;将稳定表达株无血清饥饿24 h,加入GZMA（500nmol/L）培养1h,免疫印迹实验检测NF-κB p65以及p-NF-κB p65表达水平;抑制稳定表达株细胞NF-κB p65的表达,加入GZMA（500nmol/L）培养6 h,免疫荧光及q PCR检测自噬相关蛋白表达变化。研究结果1、外周血检测结果提示,IBD患儿较对照组患儿血小板、白细胞总数明显升高,而白蛋白、血红蛋白明显降低。IBD患儿血清及肠黏膜GZMA,肠黏膜上皮细胞自噬小体及自噬相关蛋白LC3表达均显著低于对照组。2、体外实验中,加入GZMA后,肠上皮细胞自噬相关蛋白p62的表达下调,而LC3、ATG5、Beclin的表达增多;加入GZMA后,肠上皮细胞自噬小体及自噬溶酶体生成增多。3、抑制肠上皮细胞PIEZO1的表达后,自噬相关蛋白p62的表达上调,而LC3、ATG5、Beclin的表达下降;进一步加入GZMA后能够使肠上皮细胞自噬相关蛋白p62的表达降低,而LC3、ATG5、Beclin的表达增多。4、体外实验中,加入GZMA以及雷帕霉素后肠上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1表达增多。5、抑制肠上皮细胞PIEZO1的表达后NF-κB p65、p-NF-κB p65的表达增加,进一步加入GZMA刺激后可使NF-κB p65、p-NF-κB p65的表达减少。抑制肠上皮细胞NF-κB p65的表达后自噬相关蛋白p62表达上调,而LC3、ATG5、Beclin表达下降。结论1、IBD患儿肠上皮细胞自噬过程受损并与GZMA表达降低有关。2、GZMA激活肠上皮细胞自噬依赖于PIEZO1。3、GZMA-PIEZO1激活肠上皮细胞自噬促进紧密连接蛋白ZO-1的表达,以维持IBD患儿肠上皮屏障功能,该过程受NF-κB信号途径调控。