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1.背景脑胶质瘤起源于脑部神经胶质细胞,其发病率约占颅内肿瘤的40%～60%,其中胶质母细胞瘤占到60%左右。其是颅内所有肿瘤中发病率及死亡率最高的肿瘤之一,生长速度快,且侵袭力强。目前,胶质瘤的治疗方法为综合治疗——手术、放疗及化疗。胶质瘤在早期,就已表现为浸润性生长并向周围脑组织侵袭,手术无法完全将肿瘤从正常组织中剥离,从而导致术后复发率居高不下,预后较差。所以,亟需明确的预后指标或biomarker用以甄别复发率高及远处转移可能性大的患者,及时对他们进行综合治疗,以提高年生存率。神经母细胞瘤（glioblastoma,GBM）的高复发率可归因于对治疗具有抗性的脑肿瘤起始细胞的高迁移能力。在细胞迁移过程中,GBM细胞需要改变其细胞体积以通过狭窄的空间;这些体积变化是通过离子转运来调节离子共转运蛋白实现的,如钠-钾-氯共转运蛋白NKCC1,调节细胞内体积和Cl-积累,允许Na+、K+和Cl-离子通过质膜产生的能量运动穿过质膜。钠-钾-氯共转运体1（Na+-K+-Cl-cotransporter 1,NKCC1）是一种重要的氯离子转运体,在细胞内氯离子的维持和细胞体积调节中起到重要作用。NKCC属于阳离子-氯离子共转运体家族,共有两个成员。NKCC2特异性表达于肾脏的上皮细胞中,而NKCC1的表达较为广泛,在脑组织中不仅表达于血管内皮细胞,还广泛表达于神经元和胶质细胞中。最近的研究表明NKCC1在细胞有丝分裂的过程中的细胞体积变化起到重要作用。NKCC1的阻滞剂可以明显抑制胶质瘤细胞的增殖,NKCC1还参与到化疗药物诱发的肿瘤凋亡过程,对胶质瘤细胞的存活起到重要的作用。神经母细胞瘤内广泛存在着的低氧坏死区和血管形成,是其突出组织学的特征。有研究结果表明,缺氧可导致肿瘤部分表型改变,包括有:复发、转移、耐药性、侵袭性增强、凋亡潜能下降、多种癌基因被激活、诱导血管生成、基因扩增、胶质瘤干细胞数量增加和干细胞遗传不稳定性,从而间接导致了患者生存率下降。肿瘤转移包括多个步骤,其中侵袭是转移的前提。上皮间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）在肿瘤侵袭过程中起着重要的作用。EMT指的是上皮细胞在一些因素的作用下,失去极性及细胞间紧密连接和黏附连接,获得了浸润性和游走迁移能力,变成具备间质细胞形态和特性的细胞改变。胚胎发育和组织修复、肿瘤进展以及器官纤维化等领域中都发现并证明上皮细胞间质化发挥了重要的作用。在肿瘤发生的过程中,发生EMT的细胞转移的机会也更大。目前关于NKCC1基因的研究已经越来越明确,但是关于NKCC1在胶质瘤细胞的作用还未研究明确,本文旨在对于构建的胶质瘤细胞系NKCC1沉默后的生物学行为进行了研究,为胶质瘤治疗提供新的思路。2.材料和方法:2.1生物信息学分析2.1.1 NKCC1在GBM中的表达及EMT标志物的相关性我们利用网络在线工具——Gepia2数据库（http://gepia2.cancer-pku.cn/）,用以分析NKCC1在不同胶质瘤亚型当中表达高低与其预后时间的关系,同时还进一步查证在TCGA-GBM数据集中,NKCC1与EMT相关标志物的表达的相关性。2.1.2 TCGA-GBM转录组数据下载我们从TCGA数据库下载具有详细临床信息的155例GBM样本的转录组表达测序数据及临床信息,转录组表达数据格式为FPKM,总体生存期（Over survival,OS）为从确诊至死亡或最终随访结束的时间。2.1.3 单基因 NKCC1 的基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）我们以NKCC1高低表达程度不同将155例TCGA-GBM样本分为两组,然后使用基因集富集分析软件（version 4.0.1）对两组间基因的差异性功能富集分析。2.2实验材料及方法胶质瘤样本及临床信息收集于中国医科大学附属第一医院神经外科,自2016年7月至2018年1月,经患者本人及家属知情同意且签字,经中国医科大学附属第一医院伦理委员会批准,IRB No:2017-98-2。2.2.1免疫组织化学在实验中,我们使用免疫组织化学的方法,用以分析评估了 NKCC1在人类胶质瘤标本中的表达及与临床病理因素的相关性。病理组织的石蜡切片在60°下进行烤制,随后进行脱蜡处理,然后用不同酒精浓度梯度进行复水、水化,以便我们进行抗原修复处理,阻断过氧化物酶。当天孵育一抗,在4度冰箱过夜,第二天拿出来复温,同时用PBS无机盐溶液冲洗,最后孵育二抗,进行Diaminobenzidine（DAB）显色反应,封片后镜下观察。2.2.2免疫蛋白印记我们使用质粒干扰U87、U251细胞系中NKCC1基因表达,并使用Western blot进行验证。随后我们使用敲除的NKCC1的U87、U251细胞系进行一系列的细胞生物学功能检测。使用Western blot检测细胞EMT相关蛋白VIM,Zeb1,CDH2的表达,侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9的表达。U87及U251细胞全蛋白提取后进行BCA蛋白定量检测并计算得到蛋白浓度,配平后,100℃金属浴2 min使其蛋白变性,然后置于-20℃冷冻备用。Western Blot:配制分离胶和浓缩胶,上样同等含量的蛋白,90-120V恒压跑胶,待嗅酚蓝至凝胶底部后关闭电源,再不同条件下转膜。转膜结束后,用BD奶粉进行封闭,孵育一抗4℃过夜。第二天,拿出条带进行复温,然后在TBST溶液中在摇床上洗膜,二抗室温孵育后再用TBST洗膜,最后使用ECL发光。2.2.3细胞侵袭及迁移实验使用Transwell实验检测细胞侵袭,不同组别在铺胶或者不铺胶的情况下进行Transwell实验,染色后用,洗去残留结晶紫,准备显微镜下观察计数。2.3统计分析所有实验数据均以三个独立实验的平均值±SD表示,重复测量三次。视双尾P值小于0.05为有统计学意义。T检验测量不同组别间的差异。采用SPSS 24.0,Graphpad Prism 8.0和R 3.4.1进行统计学分析。3.结果:第一部分:在TCGA-GBM数据集中,NKCC1的高表达与间质型GBM的预后不良有关。NKCC1与EMT蛋白标志物如CdH2（N-Cadherin）,VIM（Vimentin）及Zeb1之间存在相关性。GSEA显示胶质瘤、TGF-β信号转导和EMT在NKCC1高表达表型中富集。通过免疫组化及分析61例胶质瘤临床特征发现,NKCC1在胶质瘤中的表达增加与胶质瘤分级有关。第二部分:Western blot和Transwell结果表明,感染NKCC1基因的表达可减少U251和U87细胞中的EMT相关基因的表达,同时抑制MMP-2和MMP-9的表达,以减少胶质瘤细胞的迁徙和侵袭作用。4.结论:第一部分:NKCC1在间质型胶质母细胞瘤中存在高表达,可以成为胶质瘤间质亚型较好的预测分子。NKCC1表达水平与间质型胶质母细胞瘤不良预后密切相关,同时与EMT标志蛋白呈正相关。表明NKCC1在胶质瘤EMT过程中起到一定作用。通过IHC及临床病理资料分析验证,NKCC1在随着胶质瘤等级升高表达程度也随之升高,可以作为胶质瘤不良预后相关的指标。第二部分:我干扰NKCC1的表达可降低EMT相关蛋白的表达,如:CDH2,VIM,Zeb1,同时,在体外显著削弱胶质瘤的侵袭性进展。干扰NKCC1表达后可同时降低了 CTNNB1的表达,推测NKCC1可通过Wnt/β-catenin通路调节胶质瘤中的EMT作用。综上所述,NKCC1在胶质瘤EMT作用中扮演最重要角色,可能是胶质瘤治疗中潜在的靶点。