论文部分内容阅读
目的:观察Toll样受体4(TLR4)是否参与氧化性低密度脂蛋白/β2糖蛋白I/抗β2糖蛋白I（ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI）抗体复合物诱导小鼠腹腔巨噬细胞向泡沫细胞转化，并进一步分析下游信号分子细胞核因子-κB(NF-κB)是否参与这一过程，以探讨TLR4/NF-κB轴在促进ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI诱导泡沫细胞形成及相关活性分子的表达中的作用。 方法:(1)分离C3H/HeN（TLR4正常）和C3H/HeJ（TLR4缺陷）小鼠腹腔巨噬细胞后，根据实验要求加入ox-LDL、ox-LDL/β2GPI、β2GPI/抗β2GPI、ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI、脂多糖(LPS)处理48 h，油红O染色观察两组细胞泡沫化情况;细胞内着色脂滴染料光密度(OD)定量分析泡沫细胞生成率。(2)采用Western blotting和实时荧光定量PCR检测ox-LDL、ox-LDL/β2GPI、ox-LDL/抗β2GPI、β2GPI/抗β2GPI、ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI、脂多糖(LPS)不同组合刺激C3H/HeN小鼠腹腔巨噬细胞后TLR4的表达，从而分析ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI对小鼠腹腔巨噬细胞的作用是否促进TLR4的表达。(3)Western blotting检测不同组合刺激两组小鼠腹腔巨噬细胞后，NF-κB p65总蛋白和磷酸化水平变化，从而分析ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI对小鼠腹腔巨噬细胞TLR4/NF-κB通路的影响。(4)小鼠腹腔巨噬细胞经ox-LDL、β2GPI/抗β2GPI、ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI等不同组合处理后，以实时荧光定量PCR检测细胞组织因子(TF) mRNA表达，Xa生成法检测TF活性，进而分析TLR4缺陷对TF表达的影响。(5) ox-LDL、β2GPI/抗β2GPI、ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI等不同组合处理小鼠腹腔巨噬细胞后，酶联免疫吸附法(ELISA)检测刺激后巨噬细胞上清中单核细胞趋化因子-1（MCP-1）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α)的表达变化，从而分析TLR4在细胞泡沫化过程中对活性分子表达的影响。 结果:(1) C3H/HeN小鼠组腹腔巨噬细胞经ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物刺激后泡沫细胞生成率增高，与C3H/HeJ小鼠组相比差异明显。(2) ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导C3H/HeN小鼠组腹腔巨噬细胞泡沫化过程中，TLR4表达增加，与空白对照相比差异明显(p＜0.01)。(3) ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导C3H/HeN小鼠组腹腔巨噬细胞泡沫化过程中，磷酸化-NF-κB（p-NF-κB）p65表达增加，与空白对照相比差异明显(p＜0.01)，与C3H/HeJ相比，差异有统计学意义(p＜0.01)。(4) ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导C3H/HeN小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞形成时，TF、MCP-1及TNF-α表达明显增加(p＜0.01)，与C3H/HeJ小鼠相比，差异有统计学意义(p＜0.01）。(5) C3H/HeN小鼠组中，ox-LDL/β2GPI诱导的巨噬细胞TLR4、p-NF-κB、TF、MCP-1及TNF-α表达均显著低于ox-LDL诱导的表达(p＜0.01)。 结论:(1) TLR4能够促进ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的小鼠腹腔巨噬细胞的泡沫化，提示TLR4在介导抗磷脂综合征相关的动脉粥样硬化病理进程中发挥重要作用。 (2) TLR4/NF-κB信号通路介导ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化过程，进而促进TF、MCP-1及TNF-α等活性分子的表达是其发挥作用的重要途径之一。 (3)抑制TLR4的表达及其信号通路的激活可以降低ox-LDL/β2GPI/抗β2GPI抗体复合物诱导的小鼠腹腔巨噬细胞泡沫化，并降低相关活性分子的表达，提示TLR4/NF-κB可作为预防抗磷脂综合征相关的动脉粥样硬化的靶点。 (4)β2GPI在泡沫细胞形成过程中有双重作用，在缺少抗β2GPI抗体情况下可以作为一种抗动脉粥样硬化的蛋白，通过结合ox-LDL而降低细胞泡沫化及相关活性分子的表达;在抗β2GPI抗体存在情况下可以通过促进巨噬细胞对ox-LDL吞噬及相关活性分子的表达，发挥促动脉粥样硬化的作用。