蛋白质磷酸化是一种广泛存在的蛋白质翻译后修饰,参与了许多重要的细胞活动,包括细胞分化、增殖、信号转导、分子识别和代谢过程等。在生物样品中,磷酸化蛋白/肽与多种疾病的发生和发展有着密切的联系,并且可以作为临床检测的重要的生物标志物。质谱因其高的灵敏度和准确性已经成为了一种鉴定蛋白质磷酸化的重要技术,但是蛋白质磷酸化因其低丰度,弱离子化效率以及存在非磷酸化肽的干扰,在质谱分析时存在巨大的挑战,在质谱鉴定前对磷酸化蛋白/肽进行预富集尤其必要。目前,可以开发出来许多富集磷酸化肽的策略,但是大部分策略一般倾向于优先检测出单磷酸化肽段,往往会忽略掉多磷酸化肽包含的有价值的关键信息。在磷酸化过程中,酪氨酸磷酸化虽然占比最低,但由于其在整个磷酸化过程的上游,对细胞信号的转导起着重要的作用,对癌症的发生发展也有着重要的调节功能,并且目前常用的磷酸化多肽富集方法无法区分不同的磷酸化形态,对酪氨酸磷酸化的富集主要还是依靠抗体的策略。因此,开发出对酸磷酸化肽的选择性富集有着重要的应用意义。分子印迹技术是一种重要的模拟酶与抗体的仿生技术,利用分子印迹技术制备的材料能够特异性识别目标分子,但是一般情况下存在传质慢,模板泄露以及结合能力差等问题。介孔材料因其具有有序的介孔、高比表面积、较强的热稳定性等,引起了科学家的广泛关注。本论文将分子印迹技术与介孔材料相结合,制备出分子印迹介孔材料,用于磷酸化肽的选择性识别与富集,具体包括以下三个内容:1、首先我们利用溶胶-凝胶的方法,以磷酸根为模板,APTES为功能单体,原硅酸四乙酯(TEOS)为交联剂制备了分子印迹介孔材料(MIM),并利用MALDI-TOF MS成功的鉴定了磷酸化肽。制备的分子印迹介孔材料具有特定的空腔,能够使磷酸化肽的磷酸根与空腔上的功能单体通过氢键进行结合,增加了选择性富集磷酸化肽的能力。该方法已经成功的用于β-酪蛋白酶解液以及复杂生物样品β-酪蛋白酶解液和BSA的混合物(质量比1:100)中磷酸化肽的选择性富集。2、在制备分子印迹介孔材料的基础上,我们选用果糖-1,6-二磷酸(FDP)为模板制备用于富集多磷酸化肽的分子印迹介孔材料(multi-MIM)。FDP包含两个磷酸根,在制备的过程中能够产生更多的与磷酸根相结合的位点,以便于与多磷酸化肽的多个磷酸根进行结合。我们通过优化洗涤条件,已经将该材料应用于β-酪蛋白酶解液中多磷酸化肽的选择性识别,发现其对磷酸化多肽具有良好的识别能力,证明了该方法可以很好用于富集磷酸化多肽。3、最后,我们利用表位印迹的策略,以UPTES为功能单体,苯基膦酸(PPA)为模板,制备出了分子印迹介孔材料。苯基膦酸是磷酸化酪氨酸的“表位”,实现了与磷酸化酪氨酸的有效结合。UPTES上含有脲基,它能够与磷酸根结合形成环状氢键,从而达到富集磷酸化酪氨酸的目的。对制备的材料进行了一系列的表征,并且对功能单体的浓度进行了优化。同时还对其结合能力以及富集磷酸化酪氨酸的性能进行了研究。结果表明,该材料具有高的比表面积,能够特异性的从标准肽段pSer:pTyr=1:1混合物和蛋白酶解液pTyr:β-casein=1:100中富集磷酸化酪氨酸。总之,本论文围绕磷酸化肽的富集问题,将分子印迹技术与介孔材料相结合,制备出了用于磷酸化肽选择性富集的分子印迹介孔材料,为磷酸化肽的选择性富集和鉴定提供了一种新的研究方法。