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心肌纤维化(Myocardial fibrosis，MF)是多种心血管疾病发生和发展的共同病理改变。而炎症反应参与了包括心肌梗死在内的多种心血管疾病纤维化的病理生理过程，进而加快心力衰竭的发生发展。转化生长因子(Transforming growth factor，TGF)-β1是最重要的促炎因子之一，大量研究表明，心肌纤维化时TGF-β1表达升高，发挥促纤维化的作用。因此，抑制TGF-β1信号可能成为防治心肌梗死后纤维化，减少心力衰竭发生的有效措施。
中医学认为冠心病、心肌梗死属于“胸痹”、“心痛”、“真心痛”等范畴，目前认为“热毒”是胸痹心痛发生发展的主要因素之一，临床应用清热解毒法治疗效果显著。尖叶假龙胆(Gentianella acuta，G. acuta)属龙胆科植物，具有清热解毒的功效，在内蒙古呼伦贝尔地区鄂温克族牧民中用于治疗心绞痛，疗效确切。现代药理研究显示，尖叶假龙胆及有效成分具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗心律失常和保护心肌等作用。本室前期研究发现，尖叶假龙胆能改善异丙肾上腺素(Isoproterenol，ISO)诱导的急/慢性心肌损伤，但是，尖叶假龙胆能否干预TGF-β1炎症信号通路而抑制心肌纤维化尚未见报道。
本课题通过体内、体外实验研究，给予尖叶假龙胆及其有效成分雏菊叶龙胆酮干预，观察对ISO诱导的大鼠心肌纤维化及TGF-β/Smads信号通路的影响和对TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞增殖、活化的影响，明确其抗纤维化的作用靶点。
第一部分尖叶假龙胆对ISO诱导的大鼠心肌纤维化及TGF-β1/Smads信号通路的影响
目的：探讨尖叶假龙胆对ISO诱导大鼠心肌纤维化的抑制作用，及干预TGF-β/Smads信号通路的机制。
方法：将50只SD大鼠随机分为对照组(Control)、模型组(ISO)、尖叶假龙胆低剂量(ISO+G.acuta0.3g/kg)、中剂量(ISO+G.acuta0.6g/kg)和高剂量(ISO+G.acuta1.2g/kg)干预组。除对照组，其余各组给予ISO(5 mg/kg/day)皮下注射7天，建立大鼠心肌纤维化模型。于ISO首次注射次日，尖叶假龙胆干预组灌服其水煎液，其余各组给予等量生理盐水，灌胃21天。采用HE染色、Masson染色、WGA(麦胚凝集素)染色观察心脏组织形态学及病理学改变；采用免疫组织化学染色观察CollagenⅠ、Ⅲ、α-SMA、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4的表达变化；采用Westernblotting分析心脏组织中CollagenⅠ、Ⅲ、α-SMA、TGF-β1、TβRI、TβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达和TβRI、TβRⅡ、Smad2、Smad3磷酸化水平的变化。
结果：
1.尖叶假龙胆抑制ISO诱导的大鼠心肌纤维化
HE染色结果显示，对照组大鼠心肌纤维排列整齐，心肌间质结构正常。与对照组相比，模型组可见广泛心内膜下梗死，梗死区心肌细胞变性坏死，心肌纤维结构紊乱，同时伴有大量炎细胞浸润。与模型组相比，尖叶假龙胆干预组心肌梗死面积明显减少，心肌细胞坏死、心肌纤维结构紊乱程度和炎细胞浸润明显改善。Masson染色显示，对照组可见少量蓝染的胶原纤维散在分布于细胞间质，模型组在心肌梗死区可见连及成片的蓝色胶原纤维聚积，表明有大量胶原沉积，尖叶假龙胆干预组胶原沉积较模型组明显减少。
与对照组相比，模型组左室质量指数(LVMI)明显升高(P<0.01)，不同剂量尖叶假龙胆干预组LVMI较模型组明显降低(P<0.05)。WGA染色结果显示，尖叶假龙胆可明显抑制ISO诱导的心肌细胞肥大(P<0.01)。
2.尖叶假龙胆抑制ISO诱导的CollagenⅠ、Ⅲ和α-SMA表达
心肌成纤维细胞活化是心肌纤维化的关键环节，活化的心肌成纤细胞高表达α-SMA和合成大量胶原蛋白。免疫组织化学染色分析心脏组织中CollagenⅠ、Ⅲ和α-SMA表达情况。结果显示，对照组CollagenⅠ、Ⅲ表达的阳性棕染颗粒均匀分布在细胞间质，α-SMA阳性颗粒主要着色在小血管壁，与对照组不同，模型组大鼠在心肌梗死区CollagenⅠ、Ⅲ和α-SMA表达明显升高，而不同剂量尖叶假龙胆干预组可见CollagenⅠ、Ⅲ和α-SMA的表达均明显降低。Westernblotting结果也证实，尖叶假龙胆可显著抑制ISO诱导纤维化心脏组织中CollagenⅠ、Ⅲ和α-SMA的表达(P<0.05)。
3.尖叶假龙胆抑制ISO诱导TGF-β1表达和TβR磷酸化
TGF-β1是最重要的促纤维化因子之一，主要通过活化其下游受体参与纤维化的调节，免疫组织化学染色检测心脏组织中TGF-β1表达变化。与对照组相比，模型组在心肌梗死区可见棕黄色阳性颗粒明显增多，提示TGF-β1表达上调，而给予尖叶假龙胆干预可见TGF-β1表达显著下调。Westernblotting分析显示，尖叶假龙胆可明显抑制ISO诱导纤维化心脏组织中TGF-β1、TβRI表达和TβR磷酸化水平升高(P<0.01)。
4.尖叶假龙胆抑制ISO诱导的Smads蛋白表达与磷酸化活化
Smads蛋白是受TβR调控的关键信号分子，免疫组织化学染色检测心脏组织中Smad2、Smad3和Smad4的变化。结果显示，与对照组相比，模型组可见心脏组织中Smad2、Smad3和Smad4表达均明显升高，给予尖叶假龙胆干预可见Smad2、Smad3和Smad4表达均显著降低。Westernblotting结果表明，尖叶假龙胆可明显抑制ISO诱导纤维化心脏组织中Smad2、Smad4表达上调和Smad2、Smad3磷酸化水平升高(P<0.01)。
第二部分雏菊叶龙胆酮对TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞增殖与活化的影响
目的：探讨尖叶假龙胆有效成分雏菊叶龙胆酮(Bellidifolin)对TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞增殖和表型转化的抑制作用。
方法：应用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶结合消化，采用差速贴壁法分离新生SD乳鼠的原代心肌成纤维细胞，培养并消化传代，通过观察分离细胞的形态和检测波形蛋白(Vimentin)表达鉴定心肌成纤维细胞。采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活力，给予雏菊叶龙胆酮(7.5、15、30、60、120μM)干预，观察雏菊叶龙胆酮对心肌成纤维细胞活力的影响；给予体外培养的心肌成纤维细胞TGF-β1(5、10、20 ng/ml)刺激，观察TGF-β1对心肌成纤维细胞增殖的影响；给予雏菊叶龙胆酮(15、30、60μM)预处理0.5h，再给予10ng/mlTGF-β1刺激24h，观察雏菊叶龙胆酮对TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞增殖的影响。采用Westernblotting观察TGF-β1刺激心肌成纤维细胞不同时间CollagenⅠ、Ⅲ、α-SMA、Smad3的表达和P-Smad3水平的变化；采用细胞免疫荧光染色和Westernblotting方法分析TGF-β1对心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响，及雏菊叶龙胆酮对TGF-β1诱导的细胞表型转化的抑制作用。
结果：
1.雏菊叶龙胆酮抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞增殖
倒置显微镜下观察分离的细胞呈多边形、三角形、梭形，细胞扁平，无自发性搏动，细胞免疫荧光染色检测Vimentin表达呈阳性，证明分离的细胞是心肌成纤维细胞。
采用CCK-8检测心肌成纤维细胞增殖活力。给予雏菊叶龙胆酮(7.5、15、30、60、120μM)作用心肌成纤维细胞24h，结果显示，雏菊叶龙胆酮在7.5～120μM范围内对细胞活力无明显影响(P>0.05)。给予不同浓度TGF-β1(5、10、20 ng/ml)刺激心肌成纤维细胞24h，结果显示，不同浓度TGF-β1处理均可显著诱导心肌成纤维细胞增殖(P<0.01)。给予雏菊叶龙胆酮(15、30、60μM)预处理0.5h，再给予10ng/mlTGF-β1作用24h，观察雏菊叶龙胆酮对TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞增殖的影响，结果显示，不同剂量雏菊叶龙胆酮均可显著抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞增殖(P<0.01)。
2.TGF-β1诱导心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化
给予10ng/mlTGF-β1刺激心肌成纤维细胞0、6、12、24、48、72h。结果显示，TGF-β1处理6～72h均可明显上调CollagenⅠ、Ⅲ、α-SMA的表达和显著升高Smad3磷酸化水平，以TGF-β1作用24h效果最为明显。TGF-β1(5、10、20 ng/ml)作用24h均可导致心肌成纤维细胞形态学改变。
进一步采用TGF-β1(10 ng/ml)刺激24h来观察对心肌成纤维细胞表型转化的影响。将心肌成纤维细胞分为对照组(Control)和模型组(TGF-β110ng/ml)，采用细胞免疫荧光染色分析α-SMA、CollagenⅠ和Ⅲ表达。荧光显微镜下观察CollagenⅠ、Ⅲ(绿色荧光)和α-SMA(红色荧光)的表达，结果显示，与对照组相比，给予TGF-β1处理，在心肌成纤维细胞可见红色和绿色荧光着色均显著增强，提示TGF-β1刺激可明显升高α-SMA、CollagenⅠ和Ⅲ的表达，Westernblotting结果也证实，TGF-β1可诱导心肌成纤维细胞α-SMA、CollagenⅠ和Ⅲ表达均显著上调(P<0.01)。上述结果表明，TGF-β1刺激可诱导心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。
3.雏菊叶龙胆酮抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞活化
将心肌成纤维细胞分为溶剂对照组(Control)、模型组(TGF-β1)、雏菊叶龙胆酮干预组(TGF-β1+B30)，采用细胞免疫荧光染色检测α-SMA、CollagenⅠ和Ⅲ的表达变化。结果显示，与溶剂对照组相比，给予TGF-β1刺激后心肌成纤维细胞α-SMA、CollagenⅠ和Ⅲ表达均显著增强，而雏菊叶龙胆酮干预可明显抑制α-SMA、CollagenⅠ和Ⅲ的表达。结果提示，雏菊叶龙胆酮可抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转化。
第三部分雏菊叶龙胆酮对心肌成纤维细胞中TGF-β1/Smads和p38信号通路活化的影响
目的：探讨雏菊叶龙胆酮通过干预TGF-β1经典与非经典信号通路来阐明其抑制心肌成纤维细胞活化的作用机制，并明确其作用靶点。
方法：体外培养心肌成纤维细胞，实验分为对照组(Control)、模型组(TGF-β1)、模型+溶剂对照组(TGF-β1+DMSO)、雏菊叶龙胆酮低剂量(TGF-β1+B15)、中剂量(TGF-β1+B30)、高剂量(TGF-β1+B60)干预组。模型组给予10ng/mlTGF-β1刺激24h，雏菊叶龙胆酮干预组给予不同剂量雏菊叶龙胆酮预处理0.5h，再给予10ng/mlTGF-β1作用24h。采用细胞免疫荧光染色和Westernblotting分析CollagenI、III、α-SMA的表达水平，同时观察TGF-β1经典信号通路与非经典信号通路相关蛋白表达和磷酸化水平的变化。进一步给予p38抑制剂(SB2035800.5μM)、TβRⅠ抑制剂(LY215729910μM)预处理心肌成纤维细胞0.5h，采用Westernblotting分析Smad3表达和Smad3磷酸化水平的变化。分析不同剂量雏菊叶龙胆酮对TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞表型转化的影响，以及其对TGF-β经典与非经典信号通路的干预作用和作用靶点。
结果：
1.不同剂量的雏菊叶龙胆酮抑制心肌成纤维细胞表型转化
细胞免疫荧光染色检测α-SMA、CollagenⅠ和Ⅲ的表达变化。荧光显微镜下观察CollagenⅠ、Ⅲ(绿色荧光)和α-SMA(红色荧光)的表达，结果显示，与对照组相比，给予TGF-β1处理，可见心肌成纤维细胞中α-SMA、CollagenⅠ和Ⅲ荧光染色均明显增强，而雏菊叶龙胆酮(15、30、60μM)干预均可显著降低α-SMA、CollagenⅠ和Ⅲ的荧光染色强度。Westernblotting结果证实，与对照组相比，模型组α-SMA、CollagenⅠ和Ⅲ的表达均显著上调(P<0.01)，而不同剂量的雏菊叶龙胆酮处理后α-SMA、CollagenⅠ和Ⅲ的表达均明显下调(P<0.01)。
2.雏菊叶龙胆酮抑制TGF-β1/Smads信号通路活化
细胞免疫荧光染色分析Smad2、3、4表达和Smad2、3磷酸化水平的变化。结果显示，与对照组相比，模型组心肌成纤维细胞Smad2、4表达和Smad2、3磷酸化水平显著升高，而雏菊叶龙胆酮干预后Smad2、4的表达和Smad2、3磷酸化水平均明显下降。Westernblotting结果也证实，雏菊叶龙胆酮可降低Smad2、4表达和Smad2、3磷酸化水平(P<0.05)。进一步分析Smads蛋白上游信号分子TβR的变化，结果显示，与对照组相比，TGF-β1可诱导TβRⅠ和TβRⅡ磷酸化水平升高(P<0.01)，而雏菊叶龙胆酮可抑制TGF-β1上调的TβR磷酸化水平(P<0.01)。
3.雏菊叶龙胆酮抑制TGF-β1诱导的p38信号通路活化
TβR活化后可以激活TGF-β1经典和非经典信号通路，进一步检测雏菊叶龙胆酮对ERK、p38非经典信号通路的影响。Westernblotting分析结果表明，与对照组相比，TGF-β1刺激心肌成纤维细胞对ERK蛋白表达和磷酸化水平均无显著影响(P>0.05)，对p38蛋白总量表达无明显作用(P>0.05)，却可显著上调p38磷酸化水平(P<0.01)。而雏菊叶龙胆酮可明显抑制p38磷酸化水平(P<0.05)。
4.雏菊叶龙胆酮不依赖p38信号通路抑制Smad3的磷酸化
给予p38抑制剂和TβRⅠ抑制剂观察雏菊叶龙胆酮对TGF-β经典和非经典信号通路影响的相互关系。Westernblotting检测结果显示，雏菊叶龙胆酮可明显抑制TGF-β1诱导的Smad3和p38磷酸化活化(P<0.05)，p38抑制剂对Smad3磷酸化水平无明显影响(P>0.05)，而TβRⅠ抑制剂或p38抑制剂与TβRⅠ抑制剂联合应用均可显著降低Smad3的磷酸化水平(P<0.01)。以上结果表明雏菊叶龙胆酮可抑制TGF-β经典信号通路而影响Smad3的活化，同时可阻断p38非经典信号通路磷酸化活化，雏菊叶龙胆酮对Smad3磷酸化的抑制作用可能与阻断p38信号无关。
结论：
1.体内实验表明，尖叶假龙胆可通过阻断TGF-β1/Smads信号通路的活化而抑制ISO诱导的大鼠心肌纤维化。
2.体外实验表明，尖叶假龙胆有效成分雏菊叶龙胆酮能够抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞增殖与活化，其作用机制与抑制TGF-β1/Smads经典信号通路和p38非经典信号通路有关。
中医学认为冠心病、心肌梗死属于“胸痹”、“心痛”、“真心痛”等范畴，目前认为“热毒”是胸痹心痛发生发展的主要因素之一，临床应用清热解毒法治疗效果显著。尖叶假龙胆(Gentianella acuta，G. acuta)属龙胆科植物，具有清热解毒的功效，在内蒙古呼伦贝尔地区鄂温克族牧民中用于治疗心绞痛，疗效确切。现代药理研究显示，尖叶假龙胆及有效成分具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗心律失常和保护心肌等作用。本室前期研究发现，尖叶假龙胆能改善异丙肾上腺素(Isoproterenol，ISO)诱导的急/慢性心肌损伤，但是，尖叶假龙胆能否干预TGF-β1炎症信号通路而抑制心肌纤维化尚未见报道。
本课题通过体内、体外实验研究，给予尖叶假龙胆及其有效成分雏菊叶龙胆酮干预，观察对ISO诱导的大鼠心肌纤维化及TGF-β/Smads信号通路的影响和对TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞增殖、活化的影响，明确其抗纤维化的作用靶点。
第一部分尖叶假龙胆对ISO诱导的大鼠心肌纤维化及TGF-β1/Smads信号通路的影响
目的：探讨尖叶假龙胆对ISO诱导大鼠心肌纤维化的抑制作用，及干预TGF-β/Smads信号通路的机制。
方法：将50只SD大鼠随机分为对照组(Control)、模型组(ISO)、尖叶假龙胆低剂量(ISO+G.acuta0.3g/kg)、中剂量(ISO+G.acuta0.6g/kg)和高剂量(ISO+G.acuta1.2g/kg)干预组。除对照组，其余各组给予ISO(5 mg/kg/day)皮下注射7天，建立大鼠心肌纤维化模型。于ISO首次注射次日，尖叶假龙胆干预组灌服其水煎液，其余各组给予等量生理盐水，灌胃21天。采用HE染色、Masson染色、WGA(麦胚凝集素)染色观察心脏组织形态学及病理学改变；采用免疫组织化学染色观察CollagenⅠ、Ⅲ、α-SMA、TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4的表达变化；采用Westernblotting分析心脏组织中CollagenⅠ、Ⅲ、α-SMA、TGF-β1、TβRI、TβRⅡ、Smad2、Smad3、Smad4蛋白表达和TβRI、TβRⅡ、Smad2、Smad3磷酸化水平的变化。
结果：
1.尖叶假龙胆抑制ISO诱导的大鼠心肌纤维化
HE染色结果显示，对照组大鼠心肌纤维排列整齐，心肌间质结构正常。与对照组相比，模型组可见广泛心内膜下梗死，梗死区心肌细胞变性坏死，心肌纤维结构紊乱，同时伴有大量炎细胞浸润。与模型组相比，尖叶假龙胆干预组心肌梗死面积明显减少，心肌细胞坏死、心肌纤维结构紊乱程度和炎细胞浸润明显改善。Masson染色显示，对照组可见少量蓝染的胶原纤维散在分布于细胞间质，模型组在心肌梗死区可见连及成片的蓝色胶原纤维聚积，表明有大量胶原沉积，尖叶假龙胆干预组胶原沉积较模型组明显减少。
与对照组相比，模型组左室质量指数(LVMI)明显升高(P<0.01)，不同剂量尖叶假龙胆干预组LVMI较模型组明显降低(P<0.05)。WGA染色结果显示，尖叶假龙胆可明显抑制ISO诱导的心肌细胞肥大(P<0.01)。
2.尖叶假龙胆抑制ISO诱导的CollagenⅠ、Ⅲ和α-SMA表达
心肌成纤维细胞活化是心肌纤维化的关键环节，活化的心肌成纤细胞高表达α-SMA和合成大量胶原蛋白。免疫组织化学染色分析心脏组织中CollagenⅠ、Ⅲ和α-SMA表达情况。结果显示，对照组CollagenⅠ、Ⅲ表达的阳性棕染颗粒均匀分布在细胞间质，α-SMA阳性颗粒主要着色在小血管壁，与对照组不同，模型组大鼠在心肌梗死区CollagenⅠ、Ⅲ和α-SMA表达明显升高，而不同剂量尖叶假龙胆干预组可见CollagenⅠ、Ⅲ和α-SMA的表达均明显降低。Westernblotting结果也证实，尖叶假龙胆可显著抑制ISO诱导纤维化心脏组织中CollagenⅠ、Ⅲ和α-SMA的表达(P<0.05)。
3.尖叶假龙胆抑制ISO诱导TGF-β1表达和TβR磷酸化
TGF-β1是最重要的促纤维化因子之一，主要通过活化其下游受体参与纤维化的调节，免疫组织化学染色检测心脏组织中TGF-β1表达变化。与对照组相比，模型组在心肌梗死区可见棕黄色阳性颗粒明显增多，提示TGF-β1表达上调，而给予尖叶假龙胆干预可见TGF-β1表达显著下调。Westernblotting分析显示，尖叶假龙胆可明显抑制ISO诱导纤维化心脏组织中TGF-β1、TβRI表达和TβR磷酸化水平升高(P<0.01)。
4.尖叶假龙胆抑制ISO诱导的Smads蛋白表达与磷酸化活化
Smads蛋白是受TβR调控的关键信号分子，免疫组织化学染色检测心脏组织中Smad2、Smad3和Smad4的变化。结果显示，与对照组相比，模型组可见心脏组织中Smad2、Smad3和Smad4表达均明显升高，给予尖叶假龙胆干预可见Smad2、Smad3和Smad4表达均显著降低。Westernblotting结果表明，尖叶假龙胆可明显抑制ISO诱导纤维化心脏组织中Smad2、Smad4表达上调和Smad2、Smad3磷酸化水平升高(P<0.01)。
第二部分雏菊叶龙胆酮对TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞增殖与活化的影响
目的：探讨尖叶假龙胆有效成分雏菊叶龙胆酮(Bellidifolin)对TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞增殖和表型转化的抑制作用。
方法：应用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶结合消化，采用差速贴壁法分离新生SD乳鼠的原代心肌成纤维细胞，培养并消化传代，通过观察分离细胞的形态和检测波形蛋白(Vimentin)表达鉴定心肌成纤维细胞。采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖活力，给予雏菊叶龙胆酮(7.5、15、30、60、120μM)干预，观察雏菊叶龙胆酮对心肌成纤维细胞活力的影响；给予体外培养的心肌成纤维细胞TGF-β1(5、10、20 ng/ml)刺激，观察TGF-β1对心肌成纤维细胞增殖的影响；给予雏菊叶龙胆酮(15、30、60μM)预处理0.5h，再给予10ng/mlTGF-β1刺激24h，观察雏菊叶龙胆酮对TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞增殖的影响。采用Westernblotting观察TGF-β1刺激心肌成纤维细胞不同时间CollagenⅠ、Ⅲ、α-SMA、Smad3的表达和P-Smad3水平的变化；采用细胞免疫荧光染色和Westernblotting方法分析TGF-β1对心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化的影响，及雏菊叶龙胆酮对TGF-β1诱导的细胞表型转化的抑制作用。
结果：
1.雏菊叶龙胆酮抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞增殖
倒置显微镜下观察分离的细胞呈多边形、三角形、梭形，细胞扁平，无自发性搏动，细胞免疫荧光染色检测Vimentin表达呈阳性，证明分离的细胞是心肌成纤维细胞。
采用CCK-8检测心肌成纤维细胞增殖活力。给予雏菊叶龙胆酮(7.5、15、30、60、120μM)作用心肌成纤维细胞24h，结果显示，雏菊叶龙胆酮在7.5～120μM范围内对细胞活力无明显影响(P>0.05)。给予不同浓度TGF-β1(5、10、20 ng/ml)刺激心肌成纤维细胞24h，结果显示，不同浓度TGF-β1处理均可显著诱导心肌成纤维细胞增殖(P<0.01)。给予雏菊叶龙胆酮(15、30、60μM)预处理0.5h，再给予10ng/mlTGF-β1作用24h，观察雏菊叶龙胆酮对TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞增殖的影响，结果显示，不同剂量雏菊叶龙胆酮均可显著抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞增殖(P<0.01)。
2.TGF-β1诱导心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化
给予10ng/mlTGF-β1刺激心肌成纤维细胞0、6、12、24、48、72h。结果显示，TGF-β1处理6～72h均可明显上调CollagenⅠ、Ⅲ、α-SMA的表达和显著升高Smad3磷酸化水平，以TGF-β1作用24h效果最为明显。TGF-β1(5、10、20 ng/ml)作用24h均可导致心肌成纤维细胞形态学改变。
进一步采用TGF-β1(10 ng/ml)刺激24h来观察对心肌成纤维细胞表型转化的影响。将心肌成纤维细胞分为对照组(Control)和模型组(TGF-β110ng/ml)，采用细胞免疫荧光染色分析α-SMA、CollagenⅠ和Ⅲ表达。荧光显微镜下观察CollagenⅠ、Ⅲ(绿色荧光)和α-SMA(红色荧光)的表达，结果显示，与对照组相比，给予TGF-β1处理，在心肌成纤维细胞可见红色和绿色荧光着色均显著增强，提示TGF-β1刺激可明显升高α-SMA、CollagenⅠ和Ⅲ的表达，Westernblotting结果也证实，TGF-β1可诱导心肌成纤维细胞α-SMA、CollagenⅠ和Ⅲ表达均显著上调(P<0.01)。上述结果表明，TGF-β1刺激可诱导心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。
3.雏菊叶龙胆酮抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞活化
将心肌成纤维细胞分为溶剂对照组(Control)、模型组(TGF-β1)、雏菊叶龙胆酮干预组(TGF-β1+B30)，采用细胞免疫荧光染色检测α-SMA、CollagenⅠ和Ⅲ的表达变化。结果显示，与溶剂对照组相比，给予TGF-β1刺激后心肌成纤维细胞α-SMA、CollagenⅠ和Ⅲ表达均显著增强，而雏菊叶龙胆酮干预可明显抑制α-SMA、CollagenⅠ和Ⅲ的表达。结果提示，雏菊叶龙胆酮可抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转化。
第三部分雏菊叶龙胆酮对心肌成纤维细胞中TGF-β1/Smads和p38信号通路活化的影响
目的：探讨雏菊叶龙胆酮通过干预TGF-β1经典与非经典信号通路来阐明其抑制心肌成纤维细胞活化的作用机制，并明确其作用靶点。
方法：体外培养心肌成纤维细胞，实验分为对照组(Control)、模型组(TGF-β1)、模型+溶剂对照组(TGF-β1+DMSO)、雏菊叶龙胆酮低剂量(TGF-β1+B15)、中剂量(TGF-β1+B30)、高剂量(TGF-β1+B60)干预组。模型组给予10ng/mlTGF-β1刺激24h，雏菊叶龙胆酮干预组给予不同剂量雏菊叶龙胆酮预处理0.5h，再给予10ng/mlTGF-β1作用24h。采用细胞免疫荧光染色和Westernblotting分析CollagenI、III、α-SMA的表达水平，同时观察TGF-β1经典信号通路与非经典信号通路相关蛋白表达和磷酸化水平的变化。进一步给予p38抑制剂(SB2035800.5μM)、TβRⅠ抑制剂(LY215729910μM)预处理心肌成纤维细胞0.5h，采用Westernblotting分析Smad3表达和Smad3磷酸化水平的变化。分析不同剂量雏菊叶龙胆酮对TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞表型转化的影响，以及其对TGF-β经典与非经典信号通路的干预作用和作用靶点。
结果：
1.不同剂量的雏菊叶龙胆酮抑制心肌成纤维细胞表型转化
细胞免疫荧光染色检测α-SMA、CollagenⅠ和Ⅲ的表达变化。荧光显微镜下观察CollagenⅠ、Ⅲ(绿色荧光)和α-SMA(红色荧光)的表达，结果显示，与对照组相比，给予TGF-β1处理，可见心肌成纤维细胞中α-SMA、CollagenⅠ和Ⅲ荧光染色均明显增强，而雏菊叶龙胆酮(15、30、60μM)干预均可显著降低α-SMA、CollagenⅠ和Ⅲ的荧光染色强度。Westernblotting结果证实，与对照组相比，模型组α-SMA、CollagenⅠ和Ⅲ的表达均显著上调(P<0.01)，而不同剂量的雏菊叶龙胆酮处理后α-SMA、CollagenⅠ和Ⅲ的表达均明显下调(P<0.01)。
2.雏菊叶龙胆酮抑制TGF-β1/Smads信号通路活化
细胞免疫荧光染色分析Smad2、3、4表达和Smad2、3磷酸化水平的变化。结果显示，与对照组相比，模型组心肌成纤维细胞Smad2、4表达和Smad2、3磷酸化水平显著升高，而雏菊叶龙胆酮干预后Smad2、4的表达和Smad2、3磷酸化水平均明显下降。Westernblotting结果也证实，雏菊叶龙胆酮可降低Smad2、4表达和Smad2、3磷酸化水平(P<0.05)。进一步分析Smads蛋白上游信号分子TβR的变化，结果显示，与对照组相比，TGF-β1可诱导TβRⅠ和TβRⅡ磷酸化水平升高(P<0.01)，而雏菊叶龙胆酮可抑制TGF-β1上调的TβR磷酸化水平(P<0.01)。
3.雏菊叶龙胆酮抑制TGF-β1诱导的p38信号通路活化
TβR活化后可以激活TGF-β1经典和非经典信号通路，进一步检测雏菊叶龙胆酮对ERK、p38非经典信号通路的影响。Westernblotting分析结果表明，与对照组相比，TGF-β1刺激心肌成纤维细胞对ERK蛋白表达和磷酸化水平均无显著影响(P>0.05)，对p38蛋白总量表达无明显作用(P>0.05)，却可显著上调p38磷酸化水平(P<0.01)。而雏菊叶龙胆酮可明显抑制p38磷酸化水平(P<0.05)。
4.雏菊叶龙胆酮不依赖p38信号通路抑制Smad3的磷酸化
给予p38抑制剂和TβRⅠ抑制剂观察雏菊叶龙胆酮对TGF-β经典和非经典信号通路影响的相互关系。Westernblotting检测结果显示，雏菊叶龙胆酮可明显抑制TGF-β1诱导的Smad3和p38磷酸化活化(P<0.05)，p38抑制剂对Smad3磷酸化水平无明显影响(P>0.05)，而TβRⅠ抑制剂或p38抑制剂与TβRⅠ抑制剂联合应用均可显著降低Smad3的磷酸化水平(P<0.01)。以上结果表明雏菊叶龙胆酮可抑制TGF-β经典信号通路而影响Smad3的活化，同时可阻断p38非经典信号通路磷酸化活化，雏菊叶龙胆酮对Smad3磷酸化的抑制作用可能与阻断p38信号无关。
结论：
1.体内实验表明，尖叶假龙胆可通过阻断TGF-β1/Smads信号通路的活化而抑制ISO诱导的大鼠心肌纤维化。
2.体外实验表明，尖叶假龙胆有效成分雏菊叶龙胆酮能够抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞增殖与活化，其作用机制与抑制TGF-β1/Smads经典信号通路和p38非经典信号通路有关。