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目的： 1.构建人高尔基体膜蛋白73(Golgi protein 73,GP73)基因的原核表达质粒pET-28b(+)-GP73,诱导表达、纯化人GP73重组蛋白。 2.以重组GP73蛋白作为免疫原,免疫新西兰兔,制备抗人GP73多克隆抗体,并对制备的多克隆抗体进行免疫学鉴定。 3.建立分泌人重组GP73单克隆抗体的杂交瘤细胞株,制备抗人GP73单克隆抗体,鉴定其生物学功能。 方法： 1.人GP73原核载体的构建及重组蛋白的表达和纯化以基因文库报道的人GP73基因的开放读码框为模版,PCR扩增GP73基因,将GP73基因与载体pMD-19T连接,构建重组克隆载体pMD-19T-GP73,再转化入保存菌DH5αE.coli中,提取测序正确后的pMD-19T-GP73重组质粒。双酶切pMD-19T-GP73及pET-28b(+),电泳回收GP73基因片段及pET-28b(+)质粒,构建原核表达载体pET-28b(+)-GP73,转化入BL21。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导GP73蛋白表达,并进行诱导条件摸索,用Ni-NTA亲和柱纯化融合蛋白。 2.人GP73多克隆抗体的制备及免疫学鉴定初次免疫以纯化的人GP73融合蛋白200μg为抗原与等体积弗氏完全佐剂超声充分乳化后,背部皮下注射免疫新西兰大白兔,以后每隔1周,取GP73蛋白与弗氏不完全佐剂1:1混合,充分乳化后皮下多点注射加强免疫,经4次免疫后获得抗人GP73抗血清,制备的抗血清经硫酸铵沉淀纯化后,用ELISA法和Western blot对多克隆抗体进行效价和特异性的检测,用免疫组织化学方法检测纯化抗体在不同肝组织中识别GP73的能力。 3.人GP73单克隆抗体的制备及生物学特性的鉴定以纯化的人GP73融合蛋白为免疫原,免疫8周龄的BALB/c小鼠,以聚乙二醇法融合小鼠脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞,用HAT和HT选择培养基筛选杂交瘤细胞。以纯化的GP73融合蛋白为包被抗原,以间接ELISA法筛选能够分泌抗人GP73单克隆抗体的阳性克隆,以有限稀释法进行阳性孔的克隆化。对获得的稳定分泌抗GP73单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以体内诱生法制备腹水,再通过Western blot和间接ELISA法来鉴定单克隆抗体的特异性、效价、亲和力及亚型。 研究结果： 1.(1)GP73基因扩增成功,与pMD-19T连接后成功构建了载体pMD-19T-GP73,序列测定结果证实重组载体中GP73基因片段序列正确。 (2)将双酶切后回收的重组载体pMD-19T-GP73和pET-28b(+)的目的片段连接,成功构建了重组表达载体pET-28b(+)-GP73。重组表达载体pET-28b(+)-GP73经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳显示,在诱导的菌液碎菌的上清中出现蛋白分子质量约为63kDa的目的蛋白,与预期值相符。 (3)将GP73蛋白挂Ni-NTA亲和柱纯化后用梯度浓度咪唑缓冲液洗脱,将洗脱液行SDS-PAGE电泳,结果显示500mmlo/L咪唑缓冲液洗脱的融合蛋白较理想,而其他浓度咪唑缓冲液洗脱效果不佳。 2.成功获得纯化的GP73蛋白及兔抗GP73多克隆抗体;ELISA法表明多克隆抗体效价>16000,Western blot检测证明多克隆抗体有良好的特异性,免疫组织化学显示GP73蛋白在正常肝组织中仅表达于胆管上皮细胞,肝细胞本身未见表达;而在肝癌组织中表达于肝癌细胞和胆管上皮细胞。 3.成功获得1株稳定分泌GP73单克隆抗体的细胞株,此单克隆抗体的抗体亚类为IgG2b类,腹水单抗的效价为1:106。Western blot结果表明,单克隆抗体能识别GP73融合蛋白且出现特异性条带。抗人GP73单克隆抗体研制成功,为进一步研究GP73蛋白的生物学特性奠定了一定的基础。 结论： 1.成功扩增了人GP73基因,构建了GP73原核表达载体pET-28b(+)-GP73,并可在BL21中高效表达,经Ni-NTA亲和层析纯化得到GP73融合蛋白。 2.成功获得GP73多克隆抗体,用ELISA法和Western blot证明了所获得抗体具有较高的效价和特异性,免疫组化进一步验证了生理和病理状态下GP73在肝脏组织中的分布。 3.成功获得1株能稳定分泌抗人GP73单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并获得了高效价高特异性的GP73单克隆抗体,为进一步研究GP73蛋白的生物学功能奠定了一定的基础。