疟疾作为一种严重的寄生虫传染病仍是全球公共安全的重大威胁。上世纪随着氯喹（Chloroquine,CQ）等抗疟药耐药性的肆虐,疟疾曾一度陷入无药可用的局面,直到屠呦呦教授团队发现青蒿素（Artemisinin,ART）这一局面才得以改善。然而,青蒿素在泰缅等疟疾高发地区已有耐药报告出现,耐药机制复杂且不明确,尚无天然小分子抑制剂作为其伴侣药物,以解决临床瓶颈问题。本课题组前期在对青蒿素工业提取废料丙酮层的系统分离中,筛选到了一种多甲氧基黄酮醇化合物（Polymethoxylated Flavones,PMFs）—猫眼草黄素（Chrysosplenetin,CHR）,研究发现猫眼草黄素虽对敏感伯氏疟原虫无效,但对抗性疟原虫却显现出特异性杀灭作用;通过抑制青蒿素代谢相关酶CYP3A4活性,同时下调介导多药耐药（Multi-drug Resistant,MDR）的P-gp（P-glycoprotein,P-gp）蛋白及基因表达,提高青蒿素体内生物利用度与抗疟活性。研究表明,细胞色素P450（Cytochrome,CYP450）的活性中心是血红素,P-gp更是参与疏水性血红素转运的关键载体。同时,P-gp与CYP3A4在体内的分布位置相近,拥有数量庞大的重叠底物与抑制剂,二者之间存在着复杂的协同效应与对话机制,血红素可能是其中关键的调节因子。而青蒿素的抗疟及耐药机制都与疟原虫血红素代谢直接相关,故猫眼草黄素作为P-gp与CYP3A4的双重抑制剂,具有成为青蒿素伴侣药物的潜力与应用前景。综上,本文进一步探究猫眼草黄素是否通过P-gp/CYP3A4对话机制,调控青蒿素耐药相关的血红素代谢异常,从而逆转其耐药性,并明确其上游调控机制。主要内容如下:1.猫眼草黄素基于P-gp/CYP3A4对话机制在不同模型下对青蒿素增效作用差异（1）以Mdr1+/+（野生型,Wide Type,WT）与Mdr1-/-（P-gp编码基因敲除型,Knock Out,KO）小鼠为研究对象,分别感染青蒿素敏感伯氏疟原虫和青蒿素抗性伯氏疟原虫,建立敏感/抗性虫株感染的WT与KO小鼠病理模型,并分别给予CMC-Na（空白对照组）、利福平（P-gp阳性诱导剂）、青蒿素单用及青蒿素-猫眼草黄素（1:2）复配,连续灌胃7d,考察不同药物处理下,不同疟原虫感染小鼠相关体征指标差异,明确P-gp与猫眼草黄素增效作用的相关性。实验结果显示,在四种小鼠模型上,单用青蒿素治疗对各疟原虫均有杀灭作用,但对抗性组作用降低,而复配给药治疗可特异性减缓青蒿素抗性疟原虫感染进程,并降低相同病程下的病重程度。同时生存曲线及小鼠体征指标等也反映出复配组小鼠的生存状态优于其他组,且KO小鼠的生存率较WT小鼠显著提升。提示猫眼草黄素作为一种潜在伴侣药物联合青蒿素使用可增强抗疟药活性,且P-gp作为一种经典的ABC转运体会参与青蒿素抗疟作用的发挥。（2）为探究猫眼草黄素增敏作用的发挥是否是通过P-gp/CYP3A4对话机制,采用RT-qPCR方法,测定各组小鼠肝脏、肾脏与小肠中Cyp3a11 mRNA表达差异。实验结果显示,空白对照组内抗性虫株感染小鼠中Cyp3a11 mRNA的表达量均高于敏感虫株感染小鼠,说明两种病理模型在青蒿素相关代谢酶表达上存在一定差异性,且Cyp3a11 mRNA表达可能与药物敏感性相关。复配给药治疗可改善抗性组中Cyp3a11 mRNA的表达情况,降低青蒿素对自身的诱导代谢,使得血药浓度得到提高,进而增强治疗效果。提示猫眼草黄素可缓解由细胞色素P450介导的疟原虫耐药,同时相比于WT小鼠,KO小鼠在给药后Cyp3a11 mRNA表达量下降程度更小,说明P-gp参与调控青蒿素对Cyp3a11的调控作用,即P-gp与CYP3A之间存在一定的对话机制,猫眼草黄素可通过这一对话机制增敏青蒿素。2.猫眼草黄素对疟原虫血红素异常代谢的调控功能为探究猫眼草黄素对各病理模型小鼠血红素-疟色素水平的影响,通过偶联酶反应法与紫外分光光度计法测定各组小鼠外周血中游离血红素含量以及肝脏、脾脏与肺中的疟色素沉积情况。实验结果显示,WT与KO小鼠模型组内,敏感组小鼠的疟色素含量均高于抗性组小鼠。单用青蒿素治疗会升高WT小鼠的疟色素含量,降低KO小鼠中疟色素含量;复配给药治疗会使各模型组的疟色素含量均下降。WT与KO小鼠模型组内,WT小鼠血红素含量均高于KO小鼠组内含量。单用青蒿素治疗会升高除KO小鼠敏感组外其他各亚组的血红素含量;复配给药治疗会升高除KO小鼠抗性组外其他各亚组的血红素含量。以上结果表明,青蒿素治疗可通过降低虫株疟色素生成致使游离血红素大量聚集,从而破坏虫体膜结构,导致虫体死亡而发挥抗疟作用。且猫眼草黄素可作为青蒿素的伴侣剂,具有增效作用,同时WT与KO小鼠的血红素-疟色素结果表明P-gp是青蒿素调控虫体血红素-疟色素代谢异常的重要节点,说明猫眼草黄素可通过P-gp/CYP3A4对话机制协同青蒿素调控虫体血红素-疟色素代谢情况。3.基于NF-κB-PXR/CAR调控通路的作用机制研究（1）PXR/CAR通路可调控多种药物代谢酶及转运体蛋白/基因的表达,因此为探究PXR/CAR通路在猫眼草黄素基于P-gp/CYP3A4对话机制对的青蒿素的增敏作用,采用RT-qPCR方法,测定各组小鼠肝脏与小肠组织中PXR/CAR mRNA表达差异。PXR mRNA结果显示,单用青蒿素或复配给药治疗对KO与WT小鼠敏感/抗性组药理作用相反,且给药干预对于KO小鼠的抗性组影响最大;CAR mRNA结果显示,单用青蒿素治疗在WT与KO小鼠中的药理作用一致,复配给药治疗在WT小鼠与KO小鼠表现出不同的药理作用。利福平组,在各组肝脏内可明显上调二者表达,但在小肠内诱导作用无显著性差异。综上,表明猫眼草黄素与青蒿素复配给药后可由PXR/CAR通路进行调控,进而通过P-gp/CYP3A4对话机制影响青蒿素抗疟作用的发挥。（2）NF-κB是P-gp/CYP3A4对话机制的共同上游通路,且与PXR/CAR存在相互调控作用。为探究NF-κB通路在猫眼草黄素基于P-gp/CYP3A4对话机制所发挥的增敏作用的调控作用,采用RT-qPCR方法,测定各组小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏、小肠及脑组织中NF-κB mRNA表达差异。实验结果显示,WT病理模型与KO病理模型相比,部分组织中NF-κB mRNA的表达量表现出相反的情况;且单用青蒿素或复配给药治疗使得敏感组与抗性组中部分脏器的NF-κB mRNA表达量下降。综上说明,青蒿素可抑制NF-κB的活化,且猫眼草黄素会促进青蒿素活性,进一步抑制NF-κB活化,且P-gp参与青蒿素对NF-κB抑制作用的发挥。因此,青蒿素-猫眼草黄素复配治疗,可通过NF-κB通路调控P-gp/CYP3A4对话机制进而更好的发挥青蒿素的药理作用。结论:猫眼草黄素本身虽无直接的抗疟活性,但与青蒿素复配使用可增强青蒿素抗疟活性,尤其对青蒿素抗性疟原虫更为有效,具有一定特异性杀灭作用,其机制可能为通过抑制NF-κB mRNA表达进而抑制NF-κB通路的激活,同时PXR/CAR作为在炎症相关反应上与NF-κB通路相互抑制的通路而被激活,相关基因转录活性增强,从而通过P-gp/CYP3A4对话机制共同调控血红素-疟色素代谢,进而改善青蒿素耐药。