论文部分内容阅读
目的：结核病是危害人类健康的最严重的传染病之一，自20世纪80年代起，已经受到控制的结核病疫情再次抬头。主要原因之一是耐多药的结核分枝杆菌菌株的日益增加，而现有的抗结核药物不能有效地治愈结核病，导致结核病患者的死亡率显著增加。因此，迫切需要研发有效的抗结核新药。结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是引起结核病的病原体。随着研究的深入发现结核分枝杆菌的细胞壁在其生存和增殖过程中起着重要的作用，并且细胞壁的组成成分和结构比较独特，是理想的药物作用的靶标。被分枝菌酸酯化的聚阿拉伯糖与聚半乳糖通过衔接双糖(L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺)共价连接到肽聚糖分子上，以形成分枝杆菌细胞壁的核心结构。衔接双糖是一重要的连接结构，破坏这一结构，细胞壁的完整性将遭到破坏从而结核分枝杆菌不能生存。衔接双糖中鼠李糖的糖基供体是dNTP-鼠李糖，四种酶(rmlB，rmlD，rmlA，rmlC)参与了由底物葡萄糖-1-磷酸合成dTDP-鼠李糖的过程，编码这四种酶的基因存在于结核分枝杆菌基因组中的不同位置。前期工作中，用基因敲除技术证明了rmlC是分枝杆菌必需生长基因。但是，当rmlC低表达时对结核分枝杆菌细胞壁的合成和细胞形态变化的影响还不清楚，需要进一步研究。
本论文的目的是构建rmlC反义表达重组质粒pMind-rmlC-AS。构建pET29b-rmlC表达重组质粒，表达并纯化RmlC蛋白免疫小鼠，制备小鼠抗RmlC蛋白多克隆抗体。电转化反义表达重组质粒 pMind-rmlC-AS到 Mcycobacterium．smegmatis mc<2> 155(以下简称mc<2>155)中，用不同浓度的四环素(Tetracycline，Tc)诱导其表达。对Tc诱导后RmlC蛋白的表达量进行检测，进一步研究rmlC基因对耻垢分枝杆菌mc<2>155细胞壁生长情况的影响，为抗结核药靶标选择提供理论支持。
本论文所获得的结果：
1.rmlC反义RNA表达载体pMind-rmlC-AS的构建从TIGR(http：//www．tigr.org/tdb/)的耻垢分枝杆菌me<2>155基因组数据库获得Sm rmlC基因的核苷酸序列(606bp)。根据其核苷酸序列设计一对PCR引物，并在上游引物和下游引物的5’端分别引入了BarnHI和NdeI限制性内切酶位点。以me<2>155基因组DNA为模板，利用PCR技术，扩增rmlC基因。将纯化的PCR产物与pSTBlue 1连接，连接产物转化到NovaBlue感受态细胞中，用限制性内切酶BamHI和Ndel，XbaI鉴定出阳性重组质粒，用测序引物T7 primer对pSTBlue 1-rmlC中的rmlC片段进行DNA宇列测定，将DNA测序结果与已知的rmlC基因进行比对分析，结果表明所克隆的rmlC DNA片段没有碱基突变。用限制性内切酶BamHI和NdeI酶切pSTBlue I-rmlC，回收与纯化rmlC DNA片段后与pMind连接，连接产物转化到DH5α感受态细胞中，用限制性内切酶BamHI和NdeI鉴定出阳性重组质粒。
2.表达载体pET29b-rmlC的构建从http：//www．tigr．org/tdb/的数据库中获得rmlC基因的核苷酸序(606bp)。根据其核苷酸序列设计一对PCR引物，并在上游引物和下游引物的5’端分别引入了NdeI和XhoI限制性内切酶位点，以便将rmlC基因克隆到pET29b表达载体的NdeI和XhoI位点。以mc<2>155基因组DNA为模板，利用PCR技术，扩增rmlC基因。将纯化的rmlC基因与pMD18-T载体进行连接，将连接产物转化到大肠杆菌NovaBlue菌株的感受态细胞中。用蓝白斑筛选法选出阳性菌落，用限制性内切酶XhoI、SacI和XhoⅠ、HindⅢ鉴定出阳性重组质粒pMD18-rmlC。用RV-M和M13-47测序引物对pMD18-rmlC中的rmlC片段进行DNA序列测定，结果表明所克隆的rmlC基因的核苷酸序列有一个突变，翻译成氨基酸后再次进行比对，氨基酸序列完全一致。用NdeI和XhoI双酶切pMD18-rmlC阳性重组质粒，回收并纯化rmlC DNA片断后，与表达载体pET29b连接，将连接产物转化到大肠杆菌NovaBlue感受念细胞中。用菌落PCR和NdeI、XhoI双酶切方法鉴定重组表达载体pET29b-rmlC，表达载体中的rmtC基因产物的N端与pET29b载体上的6个连续的组氨酸标记形成融合蛋白，便于目的蛋白的检测和纯化。
3．RmlC蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达、纯化和鉴定将质粒pET29b-rmlC转化到大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，在37℃，用1mM IPTG诱导表达4小时。超声破碎诱导的BL21(DE3)，对上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明RmlC蛋白在BL21(DE3)中表达。将100ml诱导后的BL21(DE3)大肠杆菌悬浮在5 ml Lysis Prep Buffer中，用超声方法破碎细胞后，在4℃离心 12，000g 20分钟，取上清。加入Ni-NTA柱，用20 ml Lysis Prep Buffer冲洗，再用20 ml Wash Buffer冲洗，除去未于Ni-NTA柱结合的蛋白。用10 ml的Elute Buffer洗脱，收集前5 ml洗脱液，每个EP管收集15滴。
样品经SDS-PAGE电泳后，转移到醋酸纤维素膜上，用抗多聚组氨酸的单克隆抗体及偶联碱性磷酸酶的马抗小鼠IgG二抗进行检测，结果表明，所检测到的蛋白质的分子量与预期的融合蛋白分子量一致，所表达的蛋白为rmlC基因产物4．抗RmlC蛋白抗体的制备、抗体效价的测定及鉴定以纯化的重组RmlC蛋白BALB/C小鼠，末次免疫一周后经内眦静脉采血，分离血清56℃灭活30 min，-70℃冻存。采用间接ELISA法测定效价，当稀释度为1∶6400时仍为阳性。用Western印迹鉴定小鼠抗RmlC蛋白多克隆抗体。结果表明制备的抗体具有较高的效价和特异性。
5．rmlC反义RNA在耻垢分枝杆菌mc<2>155中的表达电转化pMind-rmlC-AS到mc<2>155 感受态细胞中。分别测定mc<2>155/pMind-rmlC-AS菌株和mc<2>155菌株在Tc分别为0 ng/ml，10ng/ml，20 ng/ml，50 ng/ml和100 ng/ml条件下的生长曲线，结果表明，在未达到48小时前，mc<2>155/pMind-rmlC-AS 菌株的生长速度明显低于mc<2>155菌株。当Tc浓度为10 ng/ml和20 ng/ml时，在生长36小时时，两者菌密度差异最大。
我们分别将100 ml mc<2>155/pMind-rmlC-AS菌株和mc<2>155菌株在Tc浓度为10 ng/ml和20 ng/ml条件下培养36小时，用超声方法破碎细胞后，取上清，经SDS-PAGE电泳后，转移到醋酸纤维素膜上，用制备的鼠抗RmlC蛋白多克隆抗体及偶联碱性磷酸酶的马抗小鼠IgG二抗进行检测，结果显示在Tc浓度分别为10 ng/ml和20 ng/ml条件下，mc<2>155/pMind-rmlC-AS菌株和mc<2>155菌株中RmlC蛋白表达量并无明显差异。因此，需要进一步优化Tc对mc<2>155/pMind-rmlC-AS菌株的诱导条件，以产生更多的rmlC反义RNA分子。
结论：在本研究中，我们以mc<2>155基因组DNA为模板，用PCR的方法扩增出正确的rmlC DNA。构建了pMind-rmlC-AS反义表达载体。构建了pET29b-rmlC表达载体。表达并纯化了RmlC蛋白。用纯化的RmlC蛋白免疫BALB/C小鼠，制备了小鼠抗RmlC蛋白多克隆抗体。我们电转化pMind-rmlC-AS反义表达载体到mc<2>155菌株中，测定了mc<2>155菌株和mc<2>155/pMind-rmlC-AS菌株在不同Tc浓度下的生长曲线，检测了两种菌株在Tc的浓度分别为10 ng/ml和20 ng/ml条件下RmlC蛋白表达的差异。这一研究结果为进一步研究rmlC基因对结核分枝杆菌细胞壁合成的作用提供了条件。