研究背景Gitelman 综合征（Gitelman syndrome,GS,OMIM:263800）是以低钾血症、低镁血症和低尿钙为特征的常染色体隐性遗传病,同时可能伴有碱中毒和肾素-血管紧张素-醛固酮系统的激活,血压正常甚至偏低,是最常见的遗传性肾小管疾病。其患病率约为1:40000,亚洲人群中患病率略高,约为1:1000。其发病机制为位于16号染色体的SLC12A3发生基因突变,导致其编码的NaCl共转运体（Thiazide-sensitive sodium-chloride cotransporters,NCC）功能异常。NCC 位于肾脏远曲小管管腔面,NCC功能障碍导致NaCl重吸收减少,造成的离子重吸收紊乱导致了 GS复杂的临床症状。目前Gitelman综合征的确诊需要基因检测到SLC12A3基因双等位基因突变,基因型和表型之间的关联有待进一步探讨,治疗以口服补充钾和镁为主,一般远期预后较好。迄今为止,已经报道的SLC12A3基因突变超过500种,其中,一小部分学者对突变的NCC进行了体外的功能研究,大多数研究是在爪蟾卵母细胞上进行的,对于NCC蛋白在哺乳动物极性细胞上的功能学研究较少。对于突变NCC的体内研究,之前已经研究过的有两种点突变小鼠模型,T60M位点作为NCC经典的磷酸化位点,在亚洲人群中的突变频率很高,S707X则是一个无义突变,两种纯合子小鼠均表现为典型的Gitelman综合征的症状,但是在临床上,绝大多数Gitelman综合征患者为复合杂合子。因此,对于突变NCC完整的功能学研究和一个更好的GS疾病模型的构建问题仍有待解决。在本研究中,我们探讨了 Gitelman综合征的致病基因和两个新突变位点的致病性。我们首先在低钾血症人群中进行全外显子基因检测,筛选出Gitelman综合征患者人群,并对患者的基因型和表型进行分析。对于新突变位点R158Q和G212S进行生物信息学分析,预测突变对NCC蛋白结构可能产生的影响,并对发现的新发的突变位点进行体外的功能学研究。随后我们构建了两种点突变小鼠模型,验证了纯合点突变和复合杂合点突变小鼠模型是否有Gitelman综合征的表型,探讨了两个突变对NCC蛋白表达、定位和功能的影响,构建了更符合疾病表型的模型,为Gitelman综合征的进一步研究提供了研究基础。研究目的1.明确不明原因低血钾人群的疾病诊断。2.Gitelman综合征患者的突变汇总和基因型、表型分析。3.对SLC12A3新突变位点（R158Q和G212S）进行生物信息学分析,分析突变位点的致病性,以及突变对蛋白的三维结构可能产生的影响。4.体外研究通过转染野生型和突变NCC质粒的MDCT细胞,观察突变NCC的表达和蛋白膜定位是否异常。5.体内研究通过构建Ncc-R156Q和Ncc-G210S点突变小鼠,监测杂合小鼠、纯合小鼠、复合杂合小鼠是否具有Gitelman综合征的疾病表型,分析突变对NCC的影响。第一部分Gitelman综合征致病基因识别和基因型、表型分析研究方法1.研究对象研究对象来自山东省立医院就诊的低钾血症患者,按照严格的纳入排除标准,对符合标准的73低钾血症患者的外周血进行基因检测。2.基因检测通过全外显子测序技术（Whole-Exome Sequencing,WES）对低钾血症患者进行基因检测。3.数据收集通过对比基因测序序列,对突变位点进行统计分析,通过问诊、查体和实验室检查,获得患者的基本信息,包括血压、血清Na+、K+、Mg2+、血肌酐、血 PH、HCO3-、24h 尿量、24h Na+排泄、24h K+排泄、24h Ca2+排泄等。4.统计分析对基因检测结果进行统计分析,分析低钾血症患者基因检测阳性率、Gitelman综合征人群的基因突变特点,分析性别、突变类型对Gitelman综合征表型的影响。计量资料采用均数±标准差表示,两组间均数的比较采用Student’t t检验,采用SPSS 20.0软件进行统计学分析,P＜0.05表示有统计学差异。研究结果1.低钾血症患者基因检测阳性率为58.8%,SLC12A3突变导致的Gitelman综合征是遗传性低钾血症最常见的病因。2.SLC12A3突变在整个基因上均有分布,以复合杂合突变居多,其中,错义突变占69.4%。共发现SLC12A3基因突变46个,其中新发现的突变位点12个。3.大部分患者低镁血症,部分患者患有低尿钙,男性患者的发病年龄更早。4.基因型-表型分析:突变类型影响Gitelman综合征的严重程度,移码突变的患者血镁水平更低（P＜0.05）。研究结论1.Gitelman综合征是遗传性低钾血症最常见的原因。2.Gitelman综合征患者中,复合杂合子占大多数,其中错义突变居多。3.性别和突变类型是影响Gitelman综合征表型的重要因素。第二部分SLC12A3基因新突变位点致病机制研究研究方法1.新突变位点（c.473G＞A/p.R158Q和c.634G＞A/p.G212S）生物信息学分析。通过氨基酸位点保守性分析,突变蛋白结构预测,在线预测软件预测突变位点致病性。2.体外功能研究（1）突变蛋白表达检测:在MDCT细胞系中转染野生型和突变NCC质粒,提取细胞膜和细胞质蛋白,Western blot分析突变NCC细胞膜蛋白的表达量。（2）突变蛋白表达定位:在MDCT细胞系中转染野生型和突变NCC质粒,免疫荧光观察突变NCC和野生型NCC的细胞定位是否有差异。3.NCCR156Q/+和NCCG210S/+点突变小鼠采用Crispr Cas9的方法进行构建。4.NCCR156Q/+杂交获得 NCCR156Q/+和 NCCR156Q/R156Q,NCCG210S/+杂交获得NCCG210S/+和 NCCG210S/G210S。NCCR156Q/+和 NCCG210S/+杂交获得复合杂合子NCCR156Q/G210S。5.在小鼠12-16周龄时,测量小鼠的体重、血压。6.血尿生化监测:在小鼠12-16周龄时,经内眦静脉取小鼠静脉血,测量血清Na+,K+,Mg2+,肌酐;代谢笼收集小鼠24h尿液,记录尿量,测量尿Na+,K+,Mg2+,Ca2+,肌酐;计算尿Na+,K+,Mg2+排泄率。7.点突变小鼠Ncc表达水平评估:通过RT-PCT和Western blot检测野生型小鼠、杂合子小鼠（NccR156Q/+和NccG210S/+）、纯合子小鼠（NccR156Q/R156Q和NccG210S/G210S）、复合杂合小鼠（NccR156Q/G210S）肾脏Ncc的mRNA和蛋白水平变化。8.点突变小鼠Ncc蛋白定位评估:通过免疫荧光和免疫组化观察野生型小鼠、杂合小鼠、复合杂合小鼠Ncc的定位。9.分析性别对表型的影响:对雌性和雄性复合杂合小鼠进行表型分析,对血清K+、Mg2+水平,尿K+、Mg2+排泄率,24h尿Ca2+排泄进行分组统计分析。通过肾脏免疫组化染色观察雌性和雄性复合杂合小鼠Ncc定位是否有差异。10.相关离子通道检测:通过RT-PCR和Western blot检测雌性和雄性复合杂合小鼠的肾脏 Na+通道（Ncc）、Mg2+通道（Trpm6）、Ca2+通道（Trpv5、Trpv6）的mRNA和蛋白水平变化。11.复合杂合小鼠Ncc功能评估:氢氯噻嗪试验检测小鼠Ncc的功能。12.统计学方法。计量资料均采用均数±标准差来表示。所有数据均采用SPSS 20.0软件进行统计学分析,P＜0.05表示具有统计学差异。研究结果1.生物信息学分析两个突变均为致病性突变。两个突变位点在多物种中高度保守,Mutation Taster,PolyPhen-2,和PROVEN三个在线致病性预测软件均预测两个突变为致病突变。SWISS-MODEL三维建模发现两个突变均导致蛋白结构发生改变。2.突变导致NCC蛋白的膜表达量下降,蛋白的定位异常。与野生型NCC相比,在转染突变型NCC的MDCT细胞中,NCC蛋白的细胞膜的表达量下降,胞质中的NCC表达量升高。免疫荧光显示,野生型NCC在细胞膜表面表达,更多的突变型NCC在细胞质表达。3.和野生型小鼠相比,纯合子小鼠（Ncc1R156Q/156Q和NccG210S/G210S）、复合杂合小鼠（NccR156Q/G210S）均表现为Gitelman综合征样表型,表现为低血钾、低血镁、血压正常、体重同野生型小鼠。杂合子小鼠（NccR156Q/+和NccG210S/+）表现同野生型小鼠。4.同野生型小鼠相比,纯合子小鼠和复合杂合子小鼠肾脏Ncc的mRNA和蛋白表达显著下降。5.同野生型小鼠相比,纯合子小鼠和复合杂合子小鼠肾脏Ncc的定位异常,突变小鼠的Ncc主要定位于细胞质。6.在复合杂合小鼠中,同雌性小鼠相比,雄性小鼠血K+、血Mg2+水平,尿K+排泄率无明显差异,雄性小鼠尿Mg2+排泄增加,24h尿Ca2+排泄减少。Ncc定位在雄性和雌性小鼠中无明显差异。7.在复合杂合小鼠中,同雌性小鼠相比,雄性小鼠肾脏Trpv5和Trpv6的mRNA和蛋白表达水平上升。8.在复合杂合小鼠中,HCTZ试验证实Ncc功能障碍。研究结论1.c.473G＞A/p.R158Q和c.634G＞A/p.G212S两个突变位点预测为致病性突变。2.体外实验证实R158Q和G212S两个突变位点可能导致NCC蛋白膜表达量下降和定位异常。3.纯合子小鼠和复合杂合小鼠表现为典型的Gitelman综合征样表型,即低血钾、低血镁。4.纯合子小鼠和复合杂合小鼠的Ncc表达下降和定位异常导致的Ncc功能异常,是Gitelman综合征样表型的原因。5.在复合杂合小鼠中,雌性和雄性小鼠表型略有差异,表现为雄性小鼠的Mg2+排泄率增加和尿Ca2+排泄减少,雄性小鼠肾脏Ca2+通道（Trpv5和Trpv6）表达上调。