梅花鹿体细胞克隆胚胎构建及Ercc6l基因表达的研究

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近年来,体细胞核移植技术、转基因技术和干细胞技术等相关技术结合,陆续诞生了一批转基因克隆动物,使得哺乳动物细胞核质互作、重编程、细胞核全能性和可塑性、细胞分化和发育规律等分子机制的研究更加广泛和深入。但是体细胞核移植技术和操作程序仍不稳定,克隆动物成功率很低。普遍认为异常重编程是导致克隆效率低的主要原因之一。提高体细胞核移植效率需要从两个方面入手,一是优化体细胞核移植操作程序;二是从基因、分子和细胞水平研究核移植过程中的重编程机制,从而揭示生产克隆动物效率低的本质原因。梅花鹿基因组承受人类改造很少,是胚胎的体外生产、发育和检测一个极好的动物模型。本实验对梅花鹿体细胞克隆胚胎构建及Ercc6l基因表达进行了系统研究,其中包括梅花鹿卵母细胞的体外成熟培养条件的优化;卵母细胞的孤雌激活;转pEGFP-N1胎儿成纤维细胞系的建立;不同浓度TSA处理供核细胞H4K5蛋白信号的变化;TSA处理对克隆胚胎发育的影响;秋水酰胺和秋水仙素诱导化学性辅助去核构建克隆胚胎;发育相关Ercc6l基因的分子克隆并检测早期胚胎、胎儿和成体主要器官表达情况。结果表明:(1)繁殖季节卵母细胞的成熟率极显著高于非繁殖季节;(2)化学激活比电激活更适合梅花鹿孤雌胚胎的发育;(3)胎儿成纤维细胞比成体耳部成纤维细胞重塑潜力更大,更适合作核移植供体细胞;(4)50nMTSA处理体细胞24h作为供核细胞,再处理重构胚胎10h可以显著的提高囊胚率;(5)秋水酰胺和秋水仙素诱导化学性辅助去核比盲吸去核更加有利于胚胎的植入前发育;(6)首次克隆了梅花鹿发育相关Ercc6l基因的mRNA全序列;(7)克隆胚胎和孤雌胚胎早期不同发育阶段Ercc6l基因的表达水平没有显著差异,Ercc6l基因在胎儿、成体主要器官的表达水平随着年龄的增长而略有下降。总之,本实验对梅花鹿发育过程中Ercc6l表达量进行了检测,对梅花鹿体细胞核移植操作程序的优化进行了有益探讨和论述,为成功获得克隆梅花鹿奠定了坚实的基础。
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