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IBM1(INCREASE IN BONSAI METHYLATION 1)是组蛋白 H3K9 的去甲基化酶,能够清除活跃转录基因上的CHG甲基化。研究表明,IBM1 3’的表达受到EDM2(ENHANCED DOWNY MILDEW 2)调控,EDM2可以促进IBM1在3’末端进行多聚腺苷酸化修饰。而U1 snRNP(U1 snRNA与其结合蛋白形成的复合物)除了参与pre-mRNA内含子的剪切过程,同样具有阻止pre-mRNA多聚腺苷酸化位点提前(premature cleavage and premature polyadenylation,PCPA)的作用。此外,有文献报道U1的结合蛋白U1-70K能够抑制多聚腺苷酸化聚合酶(PolyAPolymerase,PAP)的活性,阻止poly(A)结构的形成。根据这些研究结果,我们推测EDM2和U1 snRNP在调控IBM13’多聚腺苷酸化位点选择上很可能有关系。为了研究EDM2调控IBM1 3’多聚腺苷酸化位点选择的分子机制以及证实U1 snRNP是否参与这个过程,本研究在EDM2表达量降低的edm2-5突变体背景下构建EDM2互补(即EDM2互补系)和EDM2超表达转基因(即EDM2超表达系)拟南芥,同时,在Col-0背景下利用RNA干扰技术构建了 U1表达量降低的U1 RNAi转基因株系(即U1 RNAi系,U1表达量被中度降低)。以野生型拟南芥Col-0和突变体edm2-4及edm2-5作为对照,通过表型对比、RT-PCR、Chop-PCR、酵母双杂交和突变体杂交等实验方法得出以下结论:1.RT-PCR检测结果发现,U1 RNAi系中IBM13’的表达量很低,但EDM2超表达系中IBM1 3’的表达量和Col-0相比没有明显变化。进一步检测了几个和IBM1结构类似的、内含子中包含转座子(transposable element,TE)的基因的表达量,发现这些基因的表达水平仅在edm2-4突变体中出现明显降低,而在U1 RNAi系和EDM2超表达系中均没有明显变化。最后检测若干内含子不含有TE的基因的表达量,发现这些基因在U1 RNAi系和EDM2超表达系中的表达水平和对照材料相比均没有明显差异。2.在U1 RNAi系中跨越内含子分段检测IBM1不同外显子的表达量,发现IBM1出现PCPA现象且IBM1的表达量自跨越第6个内含子开始出现明显下降,这与edm2-4突变体的检测结果类似。3.U1 RNAi系和EDM2超表达系出现相似的发育表型,它们的单株平均主茎数目和单株平均莲座叶数目明显增加。检测U1表达量时发现U1 RNAi系和EDM2超表达系中U1的表达量都出现一定程度下降。此外,利用Chop-PCR技术对U1 RNAi材料进行甲基化分析,发现它们的基因组上很多位点的CHG甲基化明显升高,这是由IBM13’表达量降低造成的。4.酵母双杂交实验结果表明EDM2和U1的结合蛋白U1-70K、多聚腺苷酸聚合酶 1(PolyA Polymerase 1,PAP1)和多聚腺苷酸聚合酶 2(PolyA Polymerase 2,PAP2)都存在蛋白相互作用。此外,edm2-4 ul-70k双突变体与edm2-4和ul-70k单突变体相比出现更加严重的发育缺陷,植株变得更加矮小、叶片变小并且角果变短等。综上所述,我们的研究结果表明,U1表达中度降低即可引起IBM1 3’多聚腺苷酸化位点提前,产生与edm2-4类似的分子表型。U1 RNAi和EDM2超表达都可以引起拟南芥体内U1表达量下降。此外,EDM2和U1的结合蛋白U1-70K、PAP1和PAP2存在蛋白-蛋白相互作用,并且EDM2和U1-70K在维持植物生长发育方面具有正协同作用。根据这些研究结果,我们推断EDM2很可能通过U1 snRNP调控IBM13’多聚腺苷酸化位点的选择。