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脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol, DON)是世界范围内最常见的霉菌毒素之一。DON进入体内后主要经过肝脏代谢和解毒，当摄入剂量超过肝脏的代谢能力时，可引起肝脏的急性、慢性损伤。最新研究显示，根据小麦粉衍生食品的消费量计算，中国居民日常DON摄入量最高为12.7μg/kgbw，而小麦来源的DON摄入占DON总摄入量的56%-100%。然而，这种相对低剂量DON的长期暴露对肝脏的影响尚不清楚。因此，探究相对低剂量DON的长期暴露对肝脏的影响不仅能为人体DON暴露的健康风险评估提供一定的依据，也能为相关食品卫生政策的完善提供理论参考。
血红素加氧酶-1(Heme oxygenase-1, HO-1)可代谢血红素，产生胆绿素、游离铁离子和一氧化碳分子(Carbon monoxide, CO)，并在细胞和组织之间的氧传递、过氧化物的代谢、外源性异物质代谢的过程中发挥重要作用。研究表明，HO-1可诱导自噬以减轻肝脏炎症、急性肝功能衰竭以及肝脏缺血再灌注损伤。并且，相关研究指出，HO-1诱导自噬的能力与CO的产生密切相关。然而，HO-1是否能作为一个分子靶点通过调控自噬来发挥肝脏保护作用目前尚不清楚。因此，探究HO-1对肝脏的保护作用及其作用机制可为人体DON暴露的防治提供新的思路，具有重要的公共卫生意义。
综上所述，本研究设计分为3步：(1)首先通过30天、90天25μg/kgbwDON小鼠体内染毒模型来探究相对低剂量DON的长期暴露对肝脏的影响，为人体DON暴露的健康风险评估提供一定的实验依据；(2)进一步通过DON体外处理来探究DON对肝细胞的损伤以及HO-1通过CO调控肝细胞自噬的作用；(3)最后通过病毒转染构建肝脏HO-1过表达/沉默小鼠的30天、90天25μg/kgbwDON染毒模型，于体内探究HO-1调控肝细胞自噬在DON致肝毒性中的作用，为人体DON暴露的防治提供新的思路。
第一部分DON的肝脏毒性
目的：探究30天、90天的25μg/kgbwDON经口染毒对肝脏的毒性作用。
方法：
(1)40只8周龄雄性C57BL/6J小鼠按体重随机均分为对照组(Control)和DON灌胃组(DON)，养于SPF级屏障系统。每天经口给予小鼠25μg/kgbwDON，于第30天、90天分别处死半数小鼠，采集生物样本。
(2)检测小鼠肝脏组织病理学改变；检测小鼠血清肝功能指标ALT和AST的活性；检测小鼠血清促炎细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的浓度。
结果：
(1)小鼠生长发育的改变：
与Control组相比，DON组小鼠体重无明显改变(P>0.05)；DON组小鼠肝脏的脏器系数增加，差异有显著性(P<0.05)。
(2)小鼠肝脏的组织病理改变：
DON染毒30天后，肝小叶中心静脉周围发生淋巴细胞浸润，DON组肝脏Ishak评分高于Control组(5.33±0.58vs.0.67±0.29)，差异有极显著性(P<0.001)。与30天DON组相比，90天DON组小叶中心静脉周围炎性浸润加重，肝脏Ishak评分进一步升高(8.00±1.00vs.5.33±0.58)，差异有极显著性(P<0.001)。
(3)小鼠肝功能的改变：
DON染毒30天后，DON组血清ALT活性高于Control组(27.87±2.95IU/Lvs.19.30±3.20IU/L)，差异有极显著性(P<0.001)；与30天DON组相比，90天DON染毒使血清ALT活性进一步升高(33.53±2.95IU/Lvs.27.87±2.95IU/L)，差异有极显著性(P<0.001)。DON染毒前后血清AST的活性无显著改变(P>0.05)。
(4)小鼠血清促炎细胞因子的改变：
DON组血清IL-6、IL-1β和TNF-α的浓度均高于Control组，差异均有显著性(P<0.05)。
结论：25μg/kgbwDON染毒30天、90天会引起小鼠肝脏轻微的炎性反应，并使血清ALT活性升高；90天DON染毒致肝损伤较30天更为显著，呈现出时间依赖效应。
第二部分DON的肝细胞毒性及HO-1调控细胞自噬的作用和机制
目的：探究DON处理对Hepa1-6细胞的影响以及HO-1通过CO调控自噬的作用和机制。
方法：
(1)确定DON的处理剂量和时间：
通过LDH试验检测DON处理后Hepa1-6细胞的活性。
(2)DON对Hepa1-6细胞的影响：
使用30nMDON分别处理Hepa1-6细胞0、1、3、6、9和12小时。通过LDH试验检测细胞活性；通过流式细胞术和Westernblot检测细胞凋亡率和凋亡相关蛋白的表达水平；通过透射电镜和DAPGreen染色观察细胞内的自噬体，通过Westernblot检测细胞内自噬相关蛋白的表达水平。
(3)HO-1调控细胞自噬的作用：
对HO-1过表达的Hepa1-6细胞(HO-1OE Hepa 1-6 cell)和HO-1沉默的Hepa1-6细胞(HO-1shRNA Hepa 1-6 cell)进行DON处理，检测各时间点的细胞活性、细胞凋亡和细胞自噬水平。
(4)HO-1保护细胞的机制：
用100μMCORM-A1预处理HO-1OEHepa1-6和HO-1shRNAHepa1-6细胞30分钟，然后对HO-1OEHepa1-6和HO-1shRNAHepa1-6细胞进行DON处理。检测各时间点的细胞活性、细胞凋亡和细胞自噬水平。
结果：
(1)DON对细胞的作用呈现出时间依赖效应和剂量依赖效应。Hepa1-6细胞的活性在30nMDON处理12小时后显著下降且细胞活性高于80%(P<0.01)。为了保证后续细胞相关检测结果的稳定性，我们选取30nM作为DON的处理剂量，选择0、1、3、6、9和12小时作为DON的处理时间。
(2)Hepa1-6细胞内的自噬水平在DON处理的1小时、3小时增强，凋亡水平在DON处理的6、9和12小时增强，差异均有显著性(P<0.05)。
(3)在DON处理12小时后，HO-1OEHepa1-6细胞的活性高于Hepa1-6细胞，在DON处理期间HO-1OEHepa1-6细胞内自噬持续的时间延长，凋亡发生的时间延后，差异均有显著性(P<0.05)；在DON处理12小时后，HO-1shRNAHepa1-6细胞的活性低于Hepa1-6细胞，在DON处理期间HO-1shRNAHepa1-6细胞内自噬被抑制，凋亡发生的时间提前，差异均有显著性(P<0.05)。
(4)相比于未经CO预处理，HO-1OEHepa1-6和HO-1shRNAHepa1-6细胞经CO预处理后，在DON处理期间细胞内自噬持续的时间进一步延长，细胞凋亡被抑制，差异均有显著性(P<0.05)。
结论：DON体外处理可以先诱导细胞自噬然后引起细胞凋亡；HO-1可以通过CO帮助延长细胞自噬，延缓诱发细胞凋亡程序。
第三部分HO-1调控肝细胞自噬在DON致肝毒性中的作用
目的：通过病毒转染构建肝脏HO-1过表达/沉默小鼠染毒模型，从体外到体内进一步探究HO-1调控细胞自噬在DON致肝毒性中的作用。
方法：
(1)40只8周龄雄性C57BL/6J小鼠按体重随机均分为HO-1过表达+DON组和HO-1沉默+DON组，养于SPF级屏障系统。通过病毒转染进行肝脏HO-1的过表达和沉默。每天经口给予小鼠25μg/kgbwDON，于第30天、90天分别处死半数小鼠，采集生物样本。
(2)检测小鼠肝脏组织病理学改变；检测小鼠血清肝功能指标ALT和AST的活性；检测小鼠血清促炎细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的浓度。
(3)连同第一部分中的Control组和DON组，通过TUNEL染色和Westernblot分别检测凋亡的肝细胞及凋亡相关蛋白的表达水平，通过透射电镜和DAPGreen染色观察肝细胞内自噬体，通过Westernblot检测细胞内自噬相关蛋白的表达水平。
结果：
(1)小鼠生长发育的改变：
与Control组相比，HO-1过表达+DON组和HO-1沉默+DON组小鼠体重无显著改变(P>0.05)；与Control组相比，HO-1过表达+DON组肝脏的脏器系数无显著改变(P>0.05)，HO-1沉默+DON组肝脏脏器系数增加，差异有极显著性(P<0.01)。
(2)小鼠肝脏的组织病理改变：
与DON组相比，HO-1过表达+DON组肝小叶中心静脉周围炎性浸润减轻，肝脏Ishak评分降低(30天：0.33±0.58vs.5.33±0.58，90天：1.67±0.58vs.8.00±1.00)，差异有极显著性(P<0.001)；HO-1沉默+DON组肝小叶中心静脉周围炎性浸润加重，肝脏Ishak评分升高(30天：7.66±1.15vs.5.33±0.58，90天：11.67±1.53vs.8.00±1.00)，差异有极显著性(P<0.001)。
(3)小鼠肝功能的改变：
与DON组相比，HO-1过表达+DON组血清ALT活性降低(30天：22.95±3.90IU/Lvs.31.00±2.95IU/L，90天：19.62±1.89IU/Lvs.32.28±4.39IU/L)，差异有显著性(P<0.05)；HO-1沉默+DON组血清ALT活性升高(30天：38.46±2.87IU/Lvs.31.00±2.95IU/L，90天：36.23±2.73IU/Lvs.32.28±4.39IU/L)，差异有极显著性(P<0.001)。
(4)小鼠血清促炎细胞因子的改变：
与DON组相比，HO-1过表达+DON组血清IL-6、IL-1β和TNF-α的浓度降低，HO-1沉默+DON组血清IL-6、IL-1β和TNF-α的浓度升高，差异均有显著性(P<0.05)。
(5)小鼠肝细胞自噬水平：
与Control组相比，DON组肝细胞内自噬颗粒增多(30天：3.5±1.0个vs.0.2±0.4个，90天：4.5±1.0个vs.0.4±0.3个)，差异有极显著性(P<0.001)；自噬上游正向调控蛋白Beclin-1、自噬体膜蛋白ATG5、ATG12和LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的表达增加，自噬底物p62减少，差异均有显著性(P<0.05)；与DON组相比，HO-1过表达+DON组肝细胞内自噬颗粒数量增多(30天：8.0±1.4个vs.3.5±1.0个，90天：8.7±1.6个vs.4.5±1.0个)，差异有极显著性(P<0.001)；Beclin-1、ATG5、ATG12和LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的表达水平升高，p62减少，差异均有显著性(P<0.05)。与DON组相比，HO-1沉默+DON组肝细胞内自噬颗粒数量减少(30天：0.3±0.5个vs.3.5±1.0个，90天：0.2±0.4个vs.4.5±1.0个)，差异有极显著性(P<0.001)；自噬相关蛋白的表达无显著改变(P>0.05)。
(6)小鼠肝细胞凋亡水平：
与Control组相比，DON组肝细胞凋亡率增加(30天：1.90±0.52%vs.0.62±0.24%，90天：3.14±0.74%vs.0.68±0.20%)，Cleavedcaspase-3和Cleavedcaspase-7的表达上调，差异均有显著性(P<0.05)；与DON组相比，HO-1过表达+DON组肝细胞凋亡率下降(30天：1.04±0.36%vs.1.90±0.52%，90天：1.48±0.41%vs.3.14±0.74%)，Cleavedcaspase-3和Cleavedcaspase-7的表达下降，差异有显著性(P<0.05)；与DON组相比，HO-1沉默+DON组肝细胞凋亡率升高(30天：4.77±0.42%vs.1.90±0.52%，90天：5.30±1.39%vs.3.14±0.74%)，Cleavedcaspase-3和Cleavedcaspase-7的表达升高，差异均有显著性(P<0.05)。
结论：25μg/kgbwDON染毒30天、90天可引起小鼠肝细胞的自噬和凋亡；HO-1可以调控肝细胞自噬来抵抗DON的肝脏毒性。
血红素加氧酶-1(Heme oxygenase-1, HO-1)可代谢血红素，产生胆绿素、游离铁离子和一氧化碳分子(Carbon monoxide, CO)，并在细胞和组织之间的氧传递、过氧化物的代谢、外源性异物质代谢的过程中发挥重要作用。研究表明，HO-1可诱导自噬以减轻肝脏炎症、急性肝功能衰竭以及肝脏缺血再灌注损伤。并且，相关研究指出，HO-1诱导自噬的能力与CO的产生密切相关。然而，HO-1是否能作为一个分子靶点通过调控自噬来发挥肝脏保护作用目前尚不清楚。因此，探究HO-1对肝脏的保护作用及其作用机制可为人体DON暴露的防治提供新的思路，具有重要的公共卫生意义。
综上所述，本研究设计分为3步：(1)首先通过30天、90天25μg/kgbwDON小鼠体内染毒模型来探究相对低剂量DON的长期暴露对肝脏的影响，为人体DON暴露的健康风险评估提供一定的实验依据；(2)进一步通过DON体外处理来探究DON对肝细胞的损伤以及HO-1通过CO调控肝细胞自噬的作用；(3)最后通过病毒转染构建肝脏HO-1过表达/沉默小鼠的30天、90天25μg/kgbwDON染毒模型，于体内探究HO-1调控肝细胞自噬在DON致肝毒性中的作用，为人体DON暴露的防治提供新的思路。
第一部分DON的肝脏毒性
目的：探究30天、90天的25μg/kgbwDON经口染毒对肝脏的毒性作用。
方法：
(1)40只8周龄雄性C57BL/6J小鼠按体重随机均分为对照组(Control)和DON灌胃组(DON)，养于SPF级屏障系统。每天经口给予小鼠25μg/kgbwDON，于第30天、90天分别处死半数小鼠，采集生物样本。
(2)检测小鼠肝脏组织病理学改变；检测小鼠血清肝功能指标ALT和AST的活性；检测小鼠血清促炎细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的浓度。
结果：
(1)小鼠生长发育的改变：
与Control组相比，DON组小鼠体重无明显改变(P>0.05)；DON组小鼠肝脏的脏器系数增加，差异有显著性(P<0.05)。
(2)小鼠肝脏的组织病理改变：
DON染毒30天后，肝小叶中心静脉周围发生淋巴细胞浸润，DON组肝脏Ishak评分高于Control组(5.33±0.58vs.0.67±0.29)，差异有极显著性(P<0.001)。与30天DON组相比，90天DON组小叶中心静脉周围炎性浸润加重，肝脏Ishak评分进一步升高(8.00±1.00vs.5.33±0.58)，差异有极显著性(P<0.001)。
(3)小鼠肝功能的改变：
DON染毒30天后，DON组血清ALT活性高于Control组(27.87±2.95IU/Lvs.19.30±3.20IU/L)，差异有极显著性(P<0.001)；与30天DON组相比，90天DON染毒使血清ALT活性进一步升高(33.53±2.95IU/Lvs.27.87±2.95IU/L)，差异有极显著性(P<0.001)。DON染毒前后血清AST的活性无显著改变(P>0.05)。
(4)小鼠血清促炎细胞因子的改变：
DON组血清IL-6、IL-1β和TNF-α的浓度均高于Control组，差异均有显著性(P<0.05)。
结论：25μg/kgbwDON染毒30天、90天会引起小鼠肝脏轻微的炎性反应，并使血清ALT活性升高；90天DON染毒致肝损伤较30天更为显著，呈现出时间依赖效应。
第二部分DON的肝细胞毒性及HO-1调控细胞自噬的作用和机制
目的：探究DON处理对Hepa1-6细胞的影响以及HO-1通过CO调控自噬的作用和机制。
方法：
(1)确定DON的处理剂量和时间：
通过LDH试验检测DON处理后Hepa1-6细胞的活性。
(2)DON对Hepa1-6细胞的影响：
使用30nMDON分别处理Hepa1-6细胞0、1、3、6、9和12小时。通过LDH试验检测细胞活性；通过流式细胞术和Westernblot检测细胞凋亡率和凋亡相关蛋白的表达水平；通过透射电镜和DAPGreen染色观察细胞内的自噬体，通过Westernblot检测细胞内自噬相关蛋白的表达水平。
(3)HO-1调控细胞自噬的作用：
对HO-1过表达的Hepa1-6细胞(HO-1OE Hepa 1-6 cell)和HO-1沉默的Hepa1-6细胞(HO-1shRNA Hepa 1-6 cell)进行DON处理，检测各时间点的细胞活性、细胞凋亡和细胞自噬水平。
(4)HO-1保护细胞的机制：
用100μMCORM-A1预处理HO-1OEHepa1-6和HO-1shRNAHepa1-6细胞30分钟，然后对HO-1OEHepa1-6和HO-1shRNAHepa1-6细胞进行DON处理。检测各时间点的细胞活性、细胞凋亡和细胞自噬水平。
结果：
(1)DON对细胞的作用呈现出时间依赖效应和剂量依赖效应。Hepa1-6细胞的活性在30nMDON处理12小时后显著下降且细胞活性高于80%(P<0.01)。为了保证后续细胞相关检测结果的稳定性，我们选取30nM作为DON的处理剂量，选择0、1、3、6、9和12小时作为DON的处理时间。
(2)Hepa1-6细胞内的自噬水平在DON处理的1小时、3小时增强，凋亡水平在DON处理的6、9和12小时增强，差异均有显著性(P<0.05)。
(3)在DON处理12小时后，HO-1OEHepa1-6细胞的活性高于Hepa1-6细胞，在DON处理期间HO-1OEHepa1-6细胞内自噬持续的时间延长，凋亡发生的时间延后，差异均有显著性(P<0.05)；在DON处理12小时后，HO-1shRNAHepa1-6细胞的活性低于Hepa1-6细胞，在DON处理期间HO-1shRNAHepa1-6细胞内自噬被抑制，凋亡发生的时间提前，差异均有显著性(P<0.05)。
(4)相比于未经CO预处理，HO-1OEHepa1-6和HO-1shRNAHepa1-6细胞经CO预处理后，在DON处理期间细胞内自噬持续的时间进一步延长，细胞凋亡被抑制，差异均有显著性(P<0.05)。
结论：DON体外处理可以先诱导细胞自噬然后引起细胞凋亡；HO-1可以通过CO帮助延长细胞自噬，延缓诱发细胞凋亡程序。
第三部分HO-1调控肝细胞自噬在DON致肝毒性中的作用
目的：通过病毒转染构建肝脏HO-1过表达/沉默小鼠染毒模型，从体外到体内进一步探究HO-1调控细胞自噬在DON致肝毒性中的作用。
方法：
(1)40只8周龄雄性C57BL/6J小鼠按体重随机均分为HO-1过表达+DON组和HO-1沉默+DON组，养于SPF级屏障系统。通过病毒转染进行肝脏HO-1的过表达和沉默。每天经口给予小鼠25μg/kgbwDON，于第30天、90天分别处死半数小鼠，采集生物样本。
(2)检测小鼠肝脏组织病理学改变；检测小鼠血清肝功能指标ALT和AST的活性；检测小鼠血清促炎细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的浓度。
(3)连同第一部分中的Control组和DON组，通过TUNEL染色和Westernblot分别检测凋亡的肝细胞及凋亡相关蛋白的表达水平，通过透射电镜和DAPGreen染色观察肝细胞内自噬体，通过Westernblot检测细胞内自噬相关蛋白的表达水平。
结果：
(1)小鼠生长发育的改变：
与Control组相比，HO-1过表达+DON组和HO-1沉默+DON组小鼠体重无显著改变(P>0.05)；与Control组相比，HO-1过表达+DON组肝脏的脏器系数无显著改变(P>0.05)，HO-1沉默+DON组肝脏脏器系数增加，差异有极显著性(P<0.01)。
(2)小鼠肝脏的组织病理改变：
与DON组相比，HO-1过表达+DON组肝小叶中心静脉周围炎性浸润减轻，肝脏Ishak评分降低(30天：0.33±0.58vs.5.33±0.58，90天：1.67±0.58vs.8.00±1.00)，差异有极显著性(P<0.001)；HO-1沉默+DON组肝小叶中心静脉周围炎性浸润加重，肝脏Ishak评分升高(30天：7.66±1.15vs.5.33±0.58，90天：11.67±1.53vs.8.00±1.00)，差异有极显著性(P<0.001)。
(3)小鼠肝功能的改变：
与DON组相比，HO-1过表达+DON组血清ALT活性降低(30天：22.95±3.90IU/Lvs.31.00±2.95IU/L，90天：19.62±1.89IU/Lvs.32.28±4.39IU/L)，差异有显著性(P<0.05)；HO-1沉默+DON组血清ALT活性升高(30天：38.46±2.87IU/Lvs.31.00±2.95IU/L，90天：36.23±2.73IU/Lvs.32.28±4.39IU/L)，差异有极显著性(P<0.001)。
(4)小鼠血清促炎细胞因子的改变：
与DON组相比，HO-1过表达+DON组血清IL-6、IL-1β和TNF-α的浓度降低，HO-1沉默+DON组血清IL-6、IL-1β和TNF-α的浓度升高，差异均有显著性(P<0.05)。
(5)小鼠肝细胞自噬水平：
与Control组相比，DON组肝细胞内自噬颗粒增多(30天：3.5±1.0个vs.0.2±0.4个，90天：4.5±1.0个vs.0.4±0.3个)，差异有极显著性(P<0.001)；自噬上游正向调控蛋白Beclin-1、自噬体膜蛋白ATG5、ATG12和LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的表达增加，自噬底物p62减少，差异均有显著性(P<0.05)；与DON组相比，HO-1过表达+DON组肝细胞内自噬颗粒数量增多(30天：8.0±1.4个vs.3.5±1.0个，90天：8.7±1.6个vs.4.5±1.0个)，差异有极显著性(P<0.001)；Beclin-1、ATG5、ATG12和LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的表达水平升高，p62减少，差异均有显著性(P<0.05)。与DON组相比，HO-1沉默+DON组肝细胞内自噬颗粒数量减少(30天：0.3±0.5个vs.3.5±1.0个，90天：0.2±0.4个vs.4.5±1.0个)，差异有极显著性(P<0.001)；自噬相关蛋白的表达无显著改变(P>0.05)。
(6)小鼠肝细胞凋亡水平：
与Control组相比，DON组肝细胞凋亡率增加(30天：1.90±0.52%vs.0.62±0.24%，90天：3.14±0.74%vs.0.68±0.20%)，Cleavedcaspase-3和Cleavedcaspase-7的表达上调，差异均有显著性(P<0.05)；与DON组相比，HO-1过表达+DON组肝细胞凋亡率下降(30天：1.04±0.36%vs.1.90±0.52%，90天：1.48±0.41%vs.3.14±0.74%)，Cleavedcaspase-3和Cleavedcaspase-7的表达下降，差异有显著性(P<0.05)；与DON组相比，HO-1沉默+DON组肝细胞凋亡率升高(30天：4.77±0.42%vs.1.90±0.52%，90天：5.30±1.39%vs.3.14±0.74%)，Cleavedcaspase-3和Cleavedcaspase-7的表达升高，差异均有显著性(P<0.05)。
结论：25μg/kgbwDON染毒30天、90天可引起小鼠肝细胞的自噬和凋亡；HO-1可以调控肝细胞自噬来抵抗DON的肝脏毒性。