【摘 要】
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目的:构建抑制COX-2基因的短发夹双链RNA(shRNA)真核表达载pshRNA-COX-2,观察其对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响方法:设计、合成1对COX-2编码基因的反向重复序列,中间间隔9
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目的:构建抑制COX-2基因的短发夹双链RNA(shRNA)真核表达载pshRNA-COX-2,观察其对肝癌细胞HepG2增殖及凋亡的影响方法:设计、合成1对COX-2编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,经退火形成互补双链,通过定向克隆至质粒pGenesil-1,构建靶向抑制COX-2基因表达的短发夹双链RNA(shRNA)真核表达载体pshRNA-COX-2。转化JM109大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定和测序分析;鉴定正确的重组表达质粒用脂质体LipofactamineTM2000转染肝癌细胞HepG2,用RT-PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平检测其对COX-2的抑制效应,用细胞计数、流式细胞仪分别检测对HepG2细胞生长和细胞周期的影响,电镜观察细胞凋亡。结果:重组表达质粒能够抑制COX-2基因表达。与未转染组相比,pshRNA-COX-2重组表达载体显著抑制了HepG2细胞COX-2 mRNA及蛋白表达,抑制率分别为69.9%和50.3%;HepG2细胞生长受到抑制;G0-G1期细胞由55.40%上升为77.89%,S期细胞由31.06%下降为16.19%;电镜显示,HepG2细胞出现凋亡。结论:成功构建了pshRNA-COX-2重组表达载体并显著抑制肝癌细胞COX-2基因表达,从而抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡,为肿瘤基因治疗的RNAi策略提供了实验依据。
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