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【目的】研究肾细胞癌组织中表达发生变化的miRNAs及其调控的靶基因对肾细胞癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为的影响,以及其靶蛋白与临床病理特征的关系及与患者生存时间的相关性,希望为肾细胞癌进行可能的分子靶向治疗提供新的理论依据及肾细胞癌患者预后提供新的可靠的标志物。【方法】第一部分:1、应用实时荧光定量PCR技术检测透明细胞性肾细胞癌组织以及对照组中miR-324-3p和miR-4313的表达水平。2、利用miRNA模拟物瞬时转染786-O和OS-RC-2两株肾细胞癌细胞,运用MTT比色法检测转染后肾细胞癌细胞的增殖能力。3、利用miRNA模拟物及其对照瞬时转染786-O细胞,细胞划痕实验检测转染后肾细胞癌细胞的迁移能力。4、利用miRNA模拟物及其对照瞬时转染786-O细胞,Transwell实验检测转染后肾细胞癌细胞的侵袭能力。5、利用miRNA模拟物及其对照瞬时转染786-O细胞,PI染色和流式细胞仪分析细胞周期时相的变化。6、利用miRNA模拟物及其对照瞬时转染786-O细胞,应用半定量PCR实验和Western-blot法检测转染后786-O细胞中细胞周期相关基因和蛋白水平的表达变化。第二部分:1、运用生物信息学技术及网络资源预测miR-4313的候选靶基因。2、应用实时荧光定量PCR方法检测转染不同浓度梯度的miR-4313模拟物后,786-O细胞中miR-4313各候选靶基因的表达水平变化。3、应用Western-blot法检测转染miR-4313模拟物后,786-O细胞中候选靶基因TBX15蛋白水平表达变化。4、应用荧光素酶双报告基因系统验证miR-4313对TBX15的3,-UTR是否具有直接抑制调控作用。第三部分:1、收集透明细胞性肾细胞癌组织以及对应的完备临床资料,并制作透明细胞性肾细胞癌组织芯片。2、基于透明细胞性肾细胞癌组织芯片,运用免疫组织化学方法,检测miR-4313的靶蛋白TBX15在人透明细胞性肾细胞癌组织和正常肾组织中的表达差异,并进行临床病理特征相关性分析和肾细胞癌患者生存分析。3、利用癌症基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库分析TBX15 m RNA在肾细胞癌组织和正常肾组织中的差异性表达,并分析TBX15 m RNA在肾细胞癌中的表达与肾细胞癌患者生存时间的关系。【结果】第一部分:1、在透明细胞性肾细胞癌组织中,miR-324-3P和miR-4313的表达水平均较对照组正常肾组织显著降低。2、转染miR-324-3p和miR-4313模拟物后,肾细胞癌细胞株786-O细胞和OS-RC-2细胞的增殖能力均明显降低,且miR-4313模拟物抑制786-O细胞增殖的能力更强。3、转染miR-324-3p和miR-4313模拟物后,786-O细胞的迁移和侵袭能力无明显改变。4、转染miR-4313模拟物后,可导致786-O细胞周期发生G0/G1期阻滞。5、转染miR-4313模拟物后,在786-O细胞中,细胞周期相关的细胞周期素cyclin D1和cyclin D3基因及其蛋白表达水平与miR-4313的表达呈负相关;而细胞周期相关的细胞周期素依赖激酶抑制因子p21、p27和p53基因及其蛋白表达与miR-4313的表达呈正相关。第二部分:1、运用生物信息学技术及现代医学网络资源,预测miR-4313的候选靶基因为UCP4、CUX1、MBD6和TBX15。2、在肾细胞癌细胞株786-O细胞中,随着miR-4313模拟物转染浓度的升高,仅有候选靶基因TBX15的表达水平逐渐下降,而其他候选靶基因UCP4、CUX1和MBD6无明显变化。3、在肾细胞癌细胞株786-O细胞中,靶蛋白TBX15的表达水平与miR-4313模拟物表达量呈负相关。4、miR-4313能够直接与靶基因TBX15的3,-UTR特异性位点互补配对结合,从而发挥其对靶基因TBX15的直接抑制调控作用。第三部分:1、收集自2009年1月至2011年12月三年间的透明细胞性肾细胞癌组织标本并制作出透明细胞性肾细胞癌组织芯片。2、与正常肾组织相比,TBX15蛋白在透明细胞性肾细胞癌组织中高表达,且具有显著差异;透明细胞性肾细胞癌组织中TBX15的表达水平与肾细胞癌远处转移及临床分期相关(p<0.05),且与肾细胞癌患者生存时间相关。3、TBX15基因在肾细胞癌组织中明显高表达;TBX15基因高表达的肾细胞癌患者生存时间明显短于TBX15基因低表达的肾细胞癌患者,即在肾细胞癌中,TBX15基因高表达与肾细胞癌患者预后差密切相关。【结论】在肾细胞癌的发生发展中,miRNAs发挥重要作用,本研究结果显示,miR-4313在肾细胞癌中表达降低,miR-4313对癌基因TBX15的抑制调控作用减弱,导致靶基因TBX15表达水平得以上调,使肾细胞癌细胞增殖能力增强,从而加速了肾细胞癌恶性演进过程;同时,TBX15表达水平与肾细胞癌患者预后相关。因此,本实验结果表明,miR-4313/TBX15信号通路参与了肾细胞癌的发生发展过程,TBX15可能成为肾细胞癌治疗的新靶点及判断肾细胞癌患者预后的新的标志物。