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目的:研究临床分离的肺炎克雷伯菌(KP)在体外形成生物被膜(BF)的情况,检测生物被膜KP中超广谱?-内酰胺酶(ESBLs)的产生,分析并探讨其耐药性和耐药基因的分型。方法:1、采用改良平板法在体外建立KP生物被膜模型,在普通光镜和扫描电镜下进行观察与鉴定;采用结晶紫染色法对形成的BF进行定量分析,并对形成BF的菌株就其标本种类进行统计学分析。2、用三维试验对建立BF模型的KP菌株中ESBLs的产生情况进行检测。3、将产ESBLs的生物被膜KP归为B组,浮游状态下的相应菌株归为A组。用K-B法对两组细菌进行药敏试验。4、用聚合酶链反应(PCR)对B组中的细菌进行blaSHV、blaTEM和blaCTX-M基因扩增,将产物分别克隆入pMD18-T载体后测定其核苷酸序列,分析其基因亚型。结果:1、临床分离的60株ESBLs阴性KP有46株在体外成功建立了BF模型。定量分析之后对其粘附性及生物被膜形成能力进行划分,结果表明弱阳性(+)为7株(15.2%),中等阳性(++)为15株(32.6%),强阳性(+++)为24株(52.2%)。对BF形成菌株就其标本种类进行检验:不同种类的标本构建成功率相似,P>0.05,无统计学差异。2、46株生物被膜KP经过三维试验检出9株(19.6%)ESBLs为阳性。3、药敏试验结果表明A组中的KP对头孢呋辛、头孢他啶耐药性较高,对头孢噻肟敏感性较低,对头孢曲松和氨曲南则较敏感。而B组中的细菌对以上药物均表现出高度耐药。4、经PCR扩增,B组中9株(100%)细菌均扩增出SHV型基因,没有单独扩增出TEM和CTX-M基因。但有4株(44.5%)细菌中同时存在SHV型和TEM型基因。5、对B组细菌基因扩增产物进行TA克隆后测序,经BLAST进行同源性比较有1株属于SHV-5型,5株属于SHV-12型,3株属于SHV-28型。TEM型均为TEM-1型。结论:1、绝大多数临床分离的ESBLs阴性KP具有粘附性及生物被膜形成能力,且以强阳性为多数。2、与其浮游状态相比,KP在BF状态下更容易产生ESBLs。3、BF的形成和产生ESBLs的协同作用是生物被膜肺炎克雷伯菌耐药性增强的主要原因之一。4、生物被膜对肺炎克雷伯菌SHV-1型基因是否具有诱导突变作用,还有待进一步研究。