论文部分内容阅读
木质素是由苯丙烷途径合成的一类多酚类高聚物，在植物次生代谢过程中起到重要作用。4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)位于苯丙烷代谢的分支点上，是木质素合成过程中的一个关键的限速酶，而漆酶是木质素单体氧化聚合成木质素过程中的一个关键的酶类。为了研究确定两个功能未知的4CL-like基因的具体功能以及与木质素单体聚合相关的关键的漆酶基因，本研究以毛果杨为实验材料对其进行了研究。 通过本研究，得到如下主要结果: 1.通过生物信息学分析初步确定毛果杨中PtrMACS1和PtrMACS2两个预测4CL-like基因可能并不是真正的4CL基因，随后通过原核表达获得这两个基因的纯化蛋白后进行酶学活性测定发现这两个基因的蛋白对中链酰基辅酶A合成酶的底物己酸、壬酸以及癸酸产生明显活性，其中对己酸的活性分别为130uMmin-1mg-1与215uMmin-1mg-1，对壬酸的活性分别为193uMmin-1mg-1与271uMmin-1mg-1，对癸酸的活性大小分别为201uMmin-1mg-1与153uMmin-1mg-1。随后本研究又对其最适反应温度和最适反应pH进行了测定，测定结果表明PtrMACS1和PtrMACS2的最适反应温度分别为37℃与35℃，最适反应pH同为7.0。以上实验结果表明PtrMACS1和PtrMACS2并不是真正的4CL基因，而是毛果杨中的中链酰基辅酶A合成酶基因。 2.首次克隆得到名为PtrLac4、PtrLac11、PtrLac16以及PtrLac29的毛果杨中4个漆酶基因的序列，生物信息学分析发现PtrLac4、PtrLac11与拟南芥中的漆酶LAC4同源性分别为67.38％和59.12％,而PtrLac16、PtrLac29与拟南芥中的漆酶LAC17的同源性分别为66.21％和72.61％,由于拟南芥中LAC4与LAC17与木质素合成相关，因此我们初步推测毛果杨中的这四个漆酶基因可能与木质素合成相关。 3.植物中漆酶基因的异源表达并未见有过报道研究，本研究将毛果杨中的四个漆酶基因与原核表达载体pET-30a(+)连接后转化大肠杆菌BL21进行诱导表达，实验结果表明这四个漆酶基因均成功进行了原核表达，这是植物漆酶基因异源表达成功的首次报道。 4.将毛果杨的四个漆酶基因与表达载体pBI-121连接构建正反义表达载体后转化农杆菌LBA4404，通过叶盘法侵染741杨，经PCR鉴定本研究获得了正义PtrLac16转基因杨树1株，正义PtrLac29转基因杨树2株，反义PtrLac4转基因杨树2株，反义PtrLac16转基因杨树1株以及反义PtrLac29转基因杨树4株。 5.通过乙酰溴法测定了野生型741杨、正义PtrLac16、正义PtrLac29以及反义PtrLac4转基因杨树的总木质素含量，测定结果表明正义PtrLac16与正义PtrLac29转基因植株相对于野生型741杨的木质素总含量在根、茎以及叶中均明显增加，增加量在40％左右。而反义PtrLac4转基因株系的木质素总含量在茎以及叶中明显降低，降低量在30％左右，该研究结果表明毛果杨漆酶基因PtrLAC4、PtrLAC16以及PtrLAC29均与木质素合成相关。 6.采用硫代酸解法以气相色谱-质谱联用仪测定了野生型741杨、正义PtrLac16以及正义PtrLac29转基因杨树的S/G，结果表明野生型741杨在根、茎以及叶中S/G分别为0.4、1.4和1.2，而正义PtrLac16在根、茎以及叶中S/G分别为0.29、1.22和0.54，其相对于野生型均明显降低。而正义PtrLac29中的S/G与野生型相比并未发生明显变化。该研究结果初步表明PtrLac16可能与G-木质素合成相关的，而PtrLac29与木质素的合成相关但与木质素单体的合成并无特异相关性。 本研究确定了两个未知4CL-like基因的具体功能，为毛果杨4CL基因家族的分类提供理论基础。毛果杨漆酶基因转基因杨树的研究为进一步研究确定木本植物木质素合成过程中关键漆酶基因的具体作用奠定了基础。