树突状细胞(dendritic cells, DC)属于专职抗原递呈细胞,其能摄取、加工、处理和递呈抗原,并将后者携带的信息呈递给T淋巴细胞,进而引发一系列免疫应答,其效率是所有该类细胞中最强的。DC参与多种病理生理过程,并具有强大的免疫调节功能,因此以DC为基础的免疫治疗已成为肿瘤治疗的一种新模式。然而DC获取困难,通过患者自体骨髓间充质干细胞分离培养和扩增后获取自体内源性DC,技术操作困难,且患者难以承受,其疗效目前尚有争议,不适合临床广泛应用。通过胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)定向分化制备DC,则具有伦理学限制,而且所得DC并非自体细胞,存在免疫排斥的可能。诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)技术的出现则为临床上DC的肿瘤免疫治疗所需的种子细胞的制备提供了另一种新途径。iPSCs是由体细胞诱导而成的干细胞,具有和ESC类似的发育多潜能性,在形态学、基因表达状况和表观遗传修饰方面都与ESC十分相似。iPSCs的应用价值在于获得方法相对简单和稳定,在技术上和伦理上都比其他方法更有优势,在再生医学中起着非常重要的作用。鉴于此,本研究拟通过多因子重编程技术,诱导小鼠成熟体细胞为iPSCs,并利用免疫组织化学、荧光、拟胚体(EB)实验、RT-PCR及Western blot等多项形态学和分子生物学技术对诱导而来的iPSCs进行分析鉴定。最后通过在iPSCs培养基中分别单独或联合添加不同的促使DC生长的细胞营养因子,将iPSCs在体外定向诱导分化为DC。目的利用逆转录病毒载体系统,通过病毒包装技术,将小鼠成纤维细胞重编程为iPSCs并对其进行鉴定。并在此基础上,将iPSCs在体外定向诱导分化为DC。材料与方法第一部分是iPSCs的诱导与鉴定。方法如下：采用逆转录病毒转染的方法将4种外源多能因子Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4质粒转染入病毒包装Plat-E细胞,搜集病毒上清感染原代培养的小鼠鼠尾成纤维细胞,观察记录多能干细胞诱导生成的过程,并对其进行鉴定分析。主要采取以下鉴定方法,1)采用碱性磷酸酶(AP)染色观察未分化的iPSCs是否具备ESC的特征,再结合形态学和免疫细胞化学的观察,鉴定iPSCs是否具有全能性；2)采用免疫荧光的方法鉴定干细胞标志物Oct、Sox2、SSEA-1在诱导而来的iPSCs表面的表达；3)拟胚体(EB)实验检测是否iPSCs能够分化发育成胚体,并用免疫荧光的方法检测胚体中是否存在3个胚层来源细胞；4) Western blot检测多能基因的蛋白表达：为进一步验证感染小鼠成纤维细胞的多能基因蛋白表达情况,利用Western blot方法检测已诱导成功的iPSCs多能因子的蛋白表达情况。所用Western抗体同免疫组化抗体；5)基因表达分析(RT-PCR):采用RT-PCR分别检测Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4多能基因在成功诱导的iPSCs、ESC M1及小鼠成纤维细胞中的表达水平,并作对比分析。第二部分为iPSCs分化为DC的研究。方法如下：将诱导成功的iPSCs基础培养体系内分别单独或联合添加不同的细胞因子,如白细胞介素IL-3(10ng/mL), IL-7(10ng/mL), IL-15(20ng/mL)。每2-3d半量换液,添加新鲜细胞因子。培养12～14d后,继续添加细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(4ng/mL)(?)肿瘤坏死因子(TNF)(50ng/mL),继续培养3～5d,倒置显微镜下观察细胞形态。结果1鼠尾成纤维细胞的培养及iPSCs的诱导采用胰酶消化法原代培养鼠尾成纤维细胞,培养次日,倒置相差显微镜下观察即可见典型的成纤维细胞特征；之后进行iPSCs的诱导,多能干细胞因子病毒感染第2d即可观察到成纤维细胞形态开始变化,细胞变平,较圆,同时出现小集落状的增殖群体。两周后可出现大量的致密而突起的克隆,细胞排列紧密,界限较清,集落边缘折光强。采用机械法挑取克隆并进行传代。2iPSCs的鉴定我们分别利用AP染色法、EB实验、Western blot及免疫荧光染色法对诱导成的iPSCs进行了鉴定,鉴定结果均符合ESC的特征；采用RT-PCR的方法检测多能基因mRNA水平,可见所建立的iPSCs细胞系与ESC相同,均表达内源性的Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4,而分化后的成纤维细胞不表达干细胞全能性基因Oct4；由于外源基因的导入,所建立的iPSCs细胞系外源基因RNA水平较高,而小鼠ESC和小鼠成纤维细胞外源性基因几乎完全沉默。3体外诱导iPSCs向DC分化体外诱导iPSCs向DC分化主要是采取在iPSCs培养基中添加几种能使干细胞向DC分化的营养因子,如IL、GM-CSF、TNF、干细胞生长因子以及DC促生长因子FMS样酪氨酸激酶3配体(FIt3L)、脂多糖等。结果可见典型的DC形态,提示iPSCs在特定因子的诱导下是可以分化为DC的。结论通过4种外源多能因子的转导,小鼠鼠尾成纤维细胞成功诱导为iPSCs,并具有iPSCs的功能和形态特征；iPSCs在特定因子的诱导下,可以成功分化为DC,具备DC的表型特征；不但为临床上DC的肿瘤免疫治疗所需的种子细胞提供了一种新的来源,同时也有助于我们了解胚胎时期DC的发育及其免疫调节作用,为临床疾病防治和药物研究提供非常有价值的实验平台。