肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝脏恶性肿瘤的最主要类型之一,其发病率居全球男性恶性肿瘤的第5位,占肿瘤相关死亡率的第3位。全世界每年肝细胞癌的新发病例大约60万例,其中80%以上发生于南非及东亚地区,而新发病例中的一半以上发生于我国。目前肝细胞癌的治疗方法包括手术治疗、肝移植、化疗、射频消融及介入栓塞等方法。但由于肝细胞癌的早期诊断困难、手术可切除率低及治疗后复发率高等问题,这些方法的远期疗效并不理想。目前,肿瘤免疫治疗已经逐渐显示出了它对包括肝细胞癌在内的多种肿瘤临床试验和治疗方面的潜力及优越性,并凭借其突破性的科学成就被《Science》评为2013年最重大的科学突破之首。人外周血T细胞中有约90-95%为αβT细胞,另有约5~10%为γδT细胞。Vγ9Vδ2T细胞为γδT细胞的主要亚群,大约占外周循环血中γδT细胞总数的50-95%,并且表达唯一的T细胞受体(T cell receptor,TCR)组合γ9TCR-δ2TCR。与αβT细胞不同的是,这类T细胞亚群能够识别自身异常细胞或肿瘤细胞通过甲羟戊酸代谢途径合成的小分子非肽类磷酸化抗原(phosphoantigens,PAgs),如异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosohate,IPP)。这一过程无抗原特异性,不依赖抗原提呈细胞(antigen-presenting cell,APC),也不受主要组织相容性抗原(major histocompatibility antigen,MHC)的限制。Vγ9Vδ2 T细胞膜表面表达的2型NK家族膜蛋白D(NK group 2 member D,NKG2D)受体可识别多种肿瘤细胞表面表达的MHC-I类分子(MIC-A/B)和UL-16结合蛋白(UL-16 binding proteins,ULBPs)。同时此类细胞具有强大的杀伤功能,可经由穿孔素(Perforin)颗粒酶(Granzyme)途径及Fas/Fas L途径杀伤多种肿瘤细胞,同时还可以分泌γ-干扰素(Interferon-γ,IFN-γ)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等多种细胞因子来增强抗肿瘤反应。GMP级的人工合成IPP或甲羟戊酸代谢抑制剂唑来膦酸(zoledronate,ZOL)与白介素-2(interleukin-2,IL-2)联合使用可选择性诱导外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)中的Vγ9Vδ2T细胞活化扩增,并已用于肿瘤患者的临床Ⅰ期和Ⅱ期细胞免疫治疗。Vγ9Vδ2T细胞可以识别并杀伤多种肿瘤细胞甚至肿瘤干细胞,并具有免疫治疗肝细胞癌的潜力。调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)可以强烈地抑制肿瘤和结核病患者血循环中γδT细胞的扩增能力并损害其免疫功能。已有多个实验证实,在不同类型的肿瘤患者外周血中都有大量Treg聚集并大量浸润入肿瘤微环境中,从而抑制了机体的抗肿瘤免疫反应。同时,亦有实验发现肝细胞癌患者外周血和肿瘤微环境中有大量Treg浸润,抑制了循环γδT细胞的瘤内浸润并直接介导了肿瘤浸润的γδT细胞功能障碍,并且与肝细胞癌的不良预后相关。在利用γδT细胞免疫治疗多种恶性肿瘤的实验中发现Treg损害了外周血γδT细胞的体外扩增能力及免疫功能。此外,有研究发现肿瘤浸润γδT细胞的亚群之一γδT17细胞能促进人大肠癌的发生发展。另外亦有研究证实,在肝癌小鼠模型的肿瘤微环境中,来源于γδT细胞的白介素-17(interleukin-17,IL-17)促进了小鼠肝癌的发生发展。肝细胞癌患者外周血γδT细胞的体外扩增能力及其与患者临床病理特征之间的相关性、抑制性细胞Treg、γδT17细胞及抑制性细胞因子IL-17在γδT细胞体外扩增过程中的变化情况、以及如何促进γδT细胞肿瘤归巢的相关实验研究至今未见相关文献报道。因此,根据已有研究结果及文献报道,我们提出如下假设:1、Zol+IL-2是否能够有效扩增不同临床特征的肝细胞癌患者外周血的γδT细胞,扩增后的γδT细胞是否能有效杀伤不同的肝癌细胞株并有可能用于临床免疫治疗肝细胞癌;2、如果γδT细胞体外扩增效果差,其原因是否与患者的某些临床病理特征相关;3、伴随着γδT细胞的体外扩增,抑制性细胞Treg、γδT17细胞及抑制性细胞因子IL-17在培养体系中是否有变化;4、是否可以通过改变肝癌细胞的趋化因子表达谱,使其表达更多的有利于γδT细胞迁移归巢的趋化因子,来达到增加γδT细胞瘤内浸润数量的目的。为证明以上假说,我们拟采用以下实验方案:1、对比分析正常人与肝细胞癌患者外周血Vγ9Vδ2T细胞体外扩增前后的数量和功能,并与不同肝癌细胞株共培养,证明肝细胞癌患者外周血γδT细胞经体外扩增后能否有效杀伤肝癌细胞。2、分析γδT细胞体外扩增效果差与患者临床病理特征的相关性;分析在γδT细胞体外扩增过程中Treg、γδT17细胞及IL-17的变化情况以论证其扩增后用于临床使用的安全性。3、分析沉默Hep G2细胞的CCR4-NOT转录复合体亚基7(CCR4-NOT transcription complex,subunit 7,CNOT7)基因后,JAK/STAT信号转导通路中的信号转导与转录激活子1(Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)及其下游调节的趋化因子之一干扰素诱导蛋白-10(interferon-inducible protein-10,IP-10)的变化情况,以及在体外分析IP-10的变化导致γδT细胞趋化能力的改变情况,并探讨发生这一现象的可能机制。第一部分肝细胞癌患者外周血γδT细胞体外扩增能力分析目的:证明Zol+IL-2可否在体外有效刺激扩增肝细胞癌患者外周血γδT细胞。方法:在获得患者及家属知情同意后,83例肝细胞癌患者纳入实验组,15名健康献血者作为对照组,使用Ficoll密度梯度离心法分别提取其外周血PBMC并计数,随后使用Zol+IL-2及GT-T551培养基扩增12-14天后,运用流式细胞仪测定并对比分析实验组和对照组扩增前后的γδT细胞数量、Vγ9Vδ2T细胞所占比例、Vγ9Vδ2T细胞亚型比例、NKG2D、Perforin、Granzyme B、CD107a、IFN-γ及TNF-α阳性细胞所占比例,最后通过MTT法检测γδT细胞对不同肝癌细胞株的体外细胞毒性。结果:扩增前后,患者Vγ9Vδ2T细胞占γδT细胞的比例与健康人相比没有明显降低。然而,扩增后,患者γδT细胞占总T细胞的比例和Vγ9Vδ2T细胞占γδT细胞比例明显增加。在细胞亚型方面,扩增后,Tna?ve和TEMRA细胞的构成比和数量明显降低,TEM细胞的构成比明显增加。另外,扩增后患者NKG2D+γδT细胞数量明显增加,达到与健康人相似的水平。在分泌和杀伤功能方面,扩增后患者Perforin+γδT细胞的百分比有所下降,明显低于健康人;Granzyme B+γδT细胞百分比在扩增后明显增加。在本实验中,扩增没有明显影响到CD107a和IFN-γ。另外,在患者外周血中,TNF-α+γδT细胞的百分比明显比健康人高,而且扩增对这一细胞群没有明显的影响。此外,MTT法分析扩增后的γδT细胞对不同肝癌细胞株的细胞毒活性,在不同的效靶比下,γδT细胞对四株不同的肝癌细胞株均有明显的杀伤毒性。另外,对Hep G2和PLC细胞株,随着效靶比的增加,其细胞毒性也明显增加。结论:Zol+IL-2能在体外够有效扩增肝细胞癌患者外周血的γδT细胞,扩增后的γδT细胞能有效杀伤不同的肝癌细胞株并有可能用于临床免疫治疗肝细胞癌。第二部分γδT细胞体外扩增能力与临床病理特征相关性及抑制性因素在扩增中变化的分析目的:探究影响肝细胞癌患者外周血γδT细胞体外扩增的因素,以及扩增过程中抑制性细胞和细胞因子的变化情况。方法:取得书面知情同意后,搜集83例患者详细临床资料并统计各数据,运用流式细胞仪检测扩增前患者和健康献血者外周血中Treg和γδT17细胞的数量。另外,运用流式细胞仪和酶联免疫吸附试验分析在扩增过程中培养体系里γδT17细胞和Treg的数量,以及γδT细胞培养上清中IL-17的变化情况。以健康献血者数据为对照,分析γδT细胞的体外扩增能力与患者临床病理特征之间的相关性,以及扩增对抑制性细胞及细胞因子的影响。此外还分析了培养体系中添加的10%自体血清中所含AFP与扩增后γδT细胞数量之间有无相关性。结果:γδT细胞扩增的质量与患者的某些临床病理特征相关。在临床病理数据方面,通过单变量分析,扩增的质量明显与临床BCLC分期、AFP水平、白蛋白,肿瘤的大小和数量、患病时间、动脉化疗栓塞、Treg和γδT17细胞的数量及IL-17的水平相关。多因素分析显示,AFP水平、Treg和γδT17细胞数量是与低质量扩增有关的独立因素,而患病时间则是与高质量的扩增有关的独立因素。伴随着γδT细胞的体外扩增,培养体系中Treg和γδT17细胞的数量及培养上清中IL-17的水平未发生明显改变。此外,培养体系中添加的10%自体血清中所含AFP与扩增后γδT细胞数量之间无相关性。结论:肝细胞癌患者外周血γδT细胞体外扩增能力与AFP水平、Treg和γδT17细胞数量及患病时间相关。扩增后的γδT细胞中抑制性细胞和细胞因子没有明显增加,可以安全用于肝细胞癌患者的临床免疫治疗。第三部分靶向沉默CNOT7促进γδT细胞趋化的体外实验及机制分析目的:分析体外扩增前后γδT细胞表面趋化因子受体CXCR3的变化情况。分析靶向沉默Hep G2细胞的CNOT7基因后,STAT1及其调控的趋化因子IP-10的变化情况,以及对扩增后的肝细胞癌患者γδT细胞体外趋化能力的改变及其可能机制。方法:首先运用流式细胞仪分析扩增前后γδT细胞表面CXCR3的表达情况;随后通过RNAi技术靶向沉默Hep G2细胞株的CNOT7基因,通过real-time PCR分析基因沉默前后STAT1 m RNA的表达情况,蛋白免疫印迹法分析STAT1及p-STAT1的表达情况;利用ELISA方法分析不同组别Hep G2细胞培养上清中IP-10的变化情况。最后通过趋化实验(Chemotaxis assay)分析沉默CNOT7前后Hep G2细胞培养上清对γδT细胞趋化能力的变化情况及其可能的机制。结果:扩增后患者CXCR3+γδT细胞的比例有所上升。沉默CNOT7后,Hep G2细胞STAT1的m RNA的表达增加,STAT1和p-STAT1蛋白表达增加,IP-10的分泌水平增加,Hep G2细胞培养上清对扩增后的肝细胞癌患者γδT细胞趋化作用加强。结论:靶向沉默Hep G2细胞的CNOT7基因可以通过调节JAK/STAT信号通路,使STAT1表达增加,并进一步调节其下游靶点IP-10,促进IP-10合成分泌增加,增加的IP-10在体外能促进扩增后的γδT细胞向肝癌细胞迁移。