苏云金芽胞杆菌(Bacilaus thuringiensis,Bt)是一种革兰氏阳性细菌,在特定条件时,能够形成芽胞,同时会产生由杀虫晶体蛋白组成的对不同宿主有毒杀活性的伴胞晶体,目前Bt已发展为一种可以与化学农药抗衡的生物农药。sRNA是一种重要的调控因子,参与调控了细菌的环境适应性、致病性等生理代谢途径。目前,关于Bt中的sRNA还没有任何的报道,甚至在蜡状芽胞杆菌群中都没有有关sRNA的研究报道。Bt作为一种昆虫、线虫病原菌,需要适应不同的环境(包括土壤环境,宿主体内环境),和毒杀宿主。我们相信Bt中很有可能存在sRNA对其环境适应性和毒力方面起着调控作用。为了寻找Bt中的sRNA并对其功能进行研究,本研究开展了以下两个工作。1.鉴定从苏云金芽胞杆菌BMB171中预测的sRNA并对其生理功能进行分析。本室从已测序的Bt基因组的BMB171中预测到了近百个sRNA,本研究从其中选择了 20个蜡状芽胞杆菌群特有的sRNA来做进一步研究,开展了以下工作。(1)候选sRNA的保守性分析:这20个sRNA保守存在于蜡状芽胞杆菌群中,2个sRNA特异存在苏云金芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌中。(2)候选sRNA的靶标预测:利用生物信息学软件预测了候选sRNA的靶标基因,用COG分析发现这些sRNA涉及多种代谢途径,氨基酸代谢和信号转导最多。(3)验证候选sRNA的真实性:利用反转录PCR确认了 8个sRNA的真实性。(4)候选sRNA生理功能的鉴定。构建候选sRNA的超表达菌株,通过检测这些突变株的生长、群体感应、压力响应等表型的变化来鉴定目标sRNA的生理功能。15个sRNA超表达菌株的表型发生变化,其中12个sRNA影响多个表型。(5)最后结合靶标的预测结果和表型检测的结果,利用KEGG分析了 sRNA可能的调控通路。2.YBT-1518中BMBsr1(sRNA)沉默Cry5Ba毒素的机制及生态学意义的研究。BMBsr1是本室在研究杀线虫Bt菌株YBT-1518中cry5Ba沉默机制时发现的一个负调控Cry5Ba毒素的一个sRNA。本研究则以BMBsr1的调控机制及其生态学意义为中心,开展了以下工作:(1)通过反转录PCR和荧光定量PCR确认了BMBsr1真实性。(2)通过EMSA证明了 BMBsr1通过与cry5B mRNA的RBS位点结合负调控Cry5Ba的表达。(3)通过western blot检测Cry5Ba蛋白的表达情况,再结合cry5B mRNA的表达情况,证明了 BMBsr1在转录后水平调控Cry5Ba形成。(4)BMBsr1通过负调控Cry5Ba毒素的形成,介导线虫的取食:通过秀丽小杆线虫对野生菌株和突变株的取食频率、拒食、趋化的比较,以及野生菌株和突变株在秀丽小杆线虫体内定殖的比较,发现BMBsr1通过负调控毒素的表达,减弱了线虫对Bt的防御行为,帮助了 Bt在线虫体内的定殖。本研究说明和大多数的细菌一样,Bt也会表达sRNA来调控Bt的环境适应性与毒力。对蜡状芽胞杆菌群特有的sRNA及其功能的鉴定,填补了蜡状芽胞杆菌群sRNA的空白,为蜡状芽胞杆菌群中sRNA的多样性分析及靶标鉴定提供了基础。通过对环境适应性和毒力相关的sRNA的研究,将有助于我们构建具有较强环境适应性和毒力的Bt工程菌株。而且通过本实验对BMBsr1的研究,能够为我们寻找隐形的杀虫晶体蛋白提供依据。