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双光子激发荧光是一种反斯托克斯发光,具有长波激发、短波发射的特点。在生物应用中,以长波长、低能量的红外光为激发光源,对生物样品穿透性强、光损伤小,可以有效避免本底荧光及散射光的干扰,减少光漂白作用,同时具有很高的空间分辨率,在生物医学等相关领域优势巨大,应用前景广阔。将双光子荧光探针用于生物分析或成像,可以克服传统单光子探针的不足,对于实现动态、原位、实时的分析检测具有重要意义。双光子荧光探针目前仍处于起步阶段,其中最主要的瓶颈就是双光子荧光团种类较少。虽然许多双光子材料具有较大的双光子吸收截面,但大多数疏水共轭结构庞大,在水溶液中量子产率低、溶解度差,并不适合用于生物分析或成像。因此,如何改进荧光团结构以提高其性能,是双光子荧光探针值得深入研究的方向。本论文以开发出适合生物应用并具有优异双光子性能的荧光团为出发点,结合不同的发光机理及检测对象,设计、合成了一系列不同类型的双光子荧光探针。主要内容如下：(1)以二苯乙烯衍生物为荧光团,设计合成了两种双光子钙离子探针TP-BAPTA和TP-CN-BAPTA。荧光团分别为D-π-D和D-π-A-π-D型的四极结构(D表示电子供体,A表示电子受体,π为共轭桥),与识别域通过π键共轭相连,发光机理为分子内电荷转移原理(ICT),结合钙离子后荧光猝灭。其中TP-BAPTA共轭链较短,双光子吸收截面有限。TP-CN-BAPTA共轭链更长且含有吸电子的氰基,发射波长和双光子吸收截面都较大,但是其分子结构容易扭曲,量子产率并不理想。探针对钙离子亲和力高,选择性好,对细胞没有毒性且对pH不敏感。TP-CN-BAPTA可以用于细胞内钙离子的双光子显微成像,并能对钙离子的浓度变化作出响应。(2)以芴的衍生物为荧光团设计合成了两种双光子钙离子探针FCal和FCa2。荧光团具有D-π-A型偶极结构,发射波长随着溶剂极性的增加显著红移。荧光团与识别域通过6键相连,探针的发光机理为光诱导电子转移原理(PET),结合钙离子后荧光有20-22倍的增强。由于芴环具有较大的共轭结构及良好的刚性平面,探针在水溶液中也保持了较高的量子产率,在740nm激发下双光子活性截面分别达到90和87GM,大大超过了传统探针的这一数值。此外,探针对钙离子亲和力适中,选择性好并且对pH不敏感。(3)以芴的衍生物为荧光团设计合成了两种双光子镁离子探针FMgl和FMg2。探针的光物理性质与前一章所合成的钙探针类似,结合镁离子后荧光有16-18倍的增强,在缓冲溶液中的量子产率分别为0.18和0.12,双光子活性截面达到76-87GM。这说明,这两种基于芴基衍生物的荧光团可以广泛用于合成不同种类的双光子荧光探针。FMgl和FMg2均能用于细胞质内镁离子的双光子显微成像,能够对镁离子的浓度变化作出响应。将FMg2和一种定位于细胞膜的双光子钙探针BCaM共同对细胞染色,可以实现Ca2+/Mg2+双色成像,并能实时监测离子浓度的动态变化,为研究Ca2+/Mg2+交换相关的生理过程提供一种重要手段。FMg2也能在生物组织中进行Ca2+/Mg2+双色成像,检测深度可达100-200μm。(4)以喹啉衍生物为荧光团合成了一种双光子一氧化氮探针QNO。荧光团以烷基胺为推电子基团,苯并噻唑为拉电子基团,具有D-π-A型偶极结构,表现出明显的溶致变色效应。邻苯二胺用作探针的识别域,对一氧化氮响应灵敏,选择性高。荧光团与识别域之间通过酰胺键相连,因此探针的发光机理为光诱导电子转移原理(PET),与一氧化氮反应后荧光有12倍的增强,量子产率达到0.2。这种含杂原子的荧光团也具有优异的双光子性质,最大双光子吸收波长位于810nm,活性截面为52GM,具有较大的应用潜力。