论文部分内容阅读
【研究目的】双向分化恶性肿瘤是指可以同时向间充质样组织和上皮样组织分化的恶性肿瘤,而上皮样分化和间充质样分化不同之处在于分化后的肿瘤细胞的形态以及组织排列两个方面。恶性黑色素瘤就是一种常见的双向分化恶性肿瘤[1]。血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)是与传统内皮依赖性血管不同的肿瘤血供形式之一,其构成不依赖于内皮细胞,而是在特定的微环境条件下肿瘤细胞自身通过塑形以及与细胞外基质相互作用而形成的血管壁类似结构,是可为肿瘤输送血液的管道,VM与肿瘤的生长、浸润和转移有着密切的关系[2,3]。由炎症细胞和炎症因子参与构成的肿瘤微环境,对肿瘤的增殖、生存和转移都有着重要影响,是肿瘤形成不可缺少的一个方面[4-10]。而白细胞介素-23(IL-23)作为肿瘤微环境中的一个重要炎性细胞因子,通常是结合细胞表面膜受体复合物,激活下游STAT3、STAT4和NF-κβ等信号通路,从而发挥其生物学功能[11,12]。“肿瘤可能起源于慢性炎症”的假说Virchow早在1863年就已提出[13],这引起了后续一系列的有关炎症和肿瘤之间关系的研究,但IL-23在黑色素瘤双向分化及血管生成拟态形成过程中所起的作用尚未见报道。本研究旨在检测IL-23在黑色素瘤中的表达并探讨IL-23在黑色素瘤双向分化及血管生成拟态(VM)形成过程中的作用,进而研究其对黑色素瘤细胞迁移侵袭能力的影响。【研究方法】1.根据IL-23在黑色素瘤细胞系A375,A875,MUM-2B,MUM-2C中的表达水平,将IL-23表达质粒转染至黑色素瘤细胞系A375,MUM-2B,MUM-2C中,使高表达的A375,MUM-2B中IL-23外源性降表达,低表达的MUM-2C中诱导IL-23外源性过表达。利用Western blot及细胞免疫荧光实验检测IL-23的转染效果。2.在倒置显微镜下观察IL-23转染后A375,MUM-2B,MUM-2C的细胞形态学改变。3.通过MTT增殖实验检测IL-23转染后A375,MUM-2B,MUM-2C细胞增殖能力的变化情况。4.利用细胞划痕实验检测IL-23转染后A375,MUM-2B,MUM-2C细胞迁移运动能力的变化情况。5.通过Transwell侵袭实验检测IL-23转染后A375,MUM-2B,MUM-2C细胞侵袭能力的变化情况。6.利用三维培养实验检测IL-23转染后A375,MUM-2B,MUM-2C细胞成管能力的变化情况。7.利用Western blot及免疫荧光实验检测IL-23转染后A375,MUM-2B,MUM-2C细胞中相关蛋白(NF-κβ、N-cadherin、Vimentin、Snail、MMP-2和VE-cadherin)表达变化情况。8.利用明胶酶谱实验检测IL-23转染后A375,MUM-2B细胞中MMP-2和MMP-9表达活性的变化情况。9.将转染的降表达A375和过表达MUM-2C黑色素瘤细胞接种至裸鼠体内,观察肿瘤成瘤及生长情况。10.包埋制成组织切片,运用Endomucin/PAS双染和免疫组化检测移植瘤组织内VM和相关蛋白(Vimentin、Snail和VE-cadherin)表达情况,分析其表达差异。【研究结果】1.Western blot及细胞免疫荧光实验结果显示经慢病毒质粒转染并药筛得到稳定的IL-23外源性降表达的A375和MUM-2B细胞,IL-23外源性过表达的MUM-2C细胞。2.在倒置显微镜下观察IL-23转染后A375,MUM-2B,MUM-2C的细胞形态发生明显改变。IL-23降表达的A375和MUM-2B细胞变大变圆,伪足减少,而IL-23过表达的MUM-2C细胞变小,呈梭型,伪足增多。3.MTT增殖实验显示IL-23降表达的A375和MUM-2B细胞增殖能力显著降低,而IL-23过表达的MUM-2C细胞增殖能力升高。4.细胞划痕实验结果显示IL-23降表达的A375和MUM-2B细胞迁移运动能力显著降低,而IL-23过表达的MUM-2C细胞迁移运动能力明显提高。5.Transwell侵袭实验显示IL-23降表达的A375和MUM-2B细胞侵袭能力显著降低,而IL-23过表达的MUM-2C细胞侵袭能力明显提高。6.三维培养实验结果显示IL-23降表达的A375和MUM-2B细胞形成管状结构的能力都显著降低,而IL-23过表达的MUM-2C细胞形成管状结构的能力明显提高。7.Western blot及免疫荧光实验结果显示IL-23降表达的A375和MUM-2B细胞间充质表型蛋白N-cad和Vimentin表达降低,VM相关蛋白MMP-2和VE-cadherin表达降低,相关调节蛋白NF-κβ、Snail表达也显著降低,而IL-23过表达的MUM-2C细胞间充质表型蛋白N-cad和Vimentin表达升高,VM相关蛋白MMP-2和VE-cadherin表达升高,相关调节蛋白NF-κβ、Snail表达也显著升高。8.明胶酶谱实验结果显示IL-23降表达的A375和MUM-2B细胞中MMP-2和MMP-9表达活性都显著降低。9.接种IL-23降表达A375和过表达MUM-2C黑色素瘤细胞的裸鼠移植瘤成瘤率及大小均明显小于对照组移植瘤。10.Endomucin/PAS双染和免疫组化结果显示接种IL-23降表达A375移植瘤组织内VM和相关蛋白(Vimentin、Snail和VE-cadherin)表达降低,接种IL-23过表达MUM-2C移植瘤组织内未形成VM而相关蛋白(Vimentin、Snail和VE-cadherin)表达均升高。【研究结论】1.IL-23可促进黑色素瘤细胞向间充质表型分化,促进黑色素瘤的增殖、迁移和侵袭,并促进黑色素瘤血管生成拟态(VM)的形成。2.IL-23可能是通过NF-κβ调节Snail的表达进而调节N-cadherin和Vimentin的表达促进黑色素瘤细胞向间充质表型分化。3.IL-23通过调节间充质表型蛋白N-cadherin和Vimentin促进黑色素瘤细胞向间充质表型分化改变细胞形态使其更易于迁移和侵袭,调节MMP-2和MMP-9表达活性提供空间结构基础,并同时调节MMP-2和VE-cadherin的表达,进而进一步促进血管生成拟态(VM)的形成。