白念珠菌是人体最常见的一种条件致病性真菌,能够以共生和致病两种状态存在于宿主微环境内。通常情况下,白念珠菌广泛存在于自然界及人体皮肤、口腔、生殖道及胃肠道粘膜表面,当机体免疫机能下降或正常寄居部位微生境失调时,容易引起浅层皮肤粘膜感染或者侵袭性感染,甚至危及生命。随着白念珠菌比较基因组学和功能基因组学的快速发展,对白念珠菌的致病机理和耐药机制的研究取得了较大进展,鉴定和阐述了多个重要毒力决定因素,包括酵母型-菌丝型形态转换、white-opaque形态转换、对宿主细胞的粘附和侵袭、胞外水解酶的分泌、生物膜的形成、pH感应和调控能力、接触感应、向触性生长和环境压力应答能力等,其中许多细胞应答过程与胞内铁稳态密切相关。铁是绝大部分生物体必需的基本营养元素,能够作为调控信号刺激生物体对外界环境作出应答。一方面,从外环境中摄取铁的能力是白念珠菌在宿主中定殖、存活和致病过程的重要影响因素；另一方面,胞内过量铁离子也容易通过芬顿反应,产生氧自由基等活性氧簇,对细胞产生毒害作用。因此,白念珠菌逐渐进化出一系列严谨的铁离子获得、储存、转运和调控系统来维持胞内铁稳态,避免铁离子浓度波动对细胞产生损伤。近年来,关于白念珠菌胞外铁离子获得系统的研究取得了较大的进展,许多铁离子获得相关基因的生物学功能已逐渐得到阐释,但是白念珠菌胞内铁离子储存转运系统的研究仍处于空白阶段。此外,尽管本实验室前期研究发现Aft2转录因子具有潜在的铁应答调控效应,但对其调控机理及参与的代谢过程尚不清楚。本研究针对以上几个问题,鉴定并阐释了白念珠菌胞内铁离子储存转运系统和Aft2转录因子介导的铁应答调控系统,同时探究其在白念珠菌压力应答、形态发生和致病过程中的重要作用,为临床上治疗白念珠菌感染和新型抗真菌药物开发提供重要的参考价值。本研究主要结果如下：(1)采用生物信息学和分子细胞生物学方法,在白念珠菌基因组数据库中检索并鉴定出线粒体膜转运蛋白Mrs4、液泡膜转运蛋白Ccc1和液泡膜转运蛋白Smf3。研究发现,Mrs4蛋白属于线粒体转运蛋白家族成员,定位于线粒体膜上,在维持线粒体形态结构及调节线粒体铁转运方面中发挥着重要作用。Ccc1蛋白主要负责向液泡中转运铁,而Smf3蛋白主要负责将液泡中储存铁释放到胞质中。三种转运蛋白能够形成Mrs4-Ccc1-Smf3(MCS)途径,协同调控白念珠菌胞内铁离子的分配和转运,在胞内铁应答和利用等代谢过程中发挥着重要作用。(2)采用PCR介导的同源重组技术,分别构建了mrs4Δ/Δ、ccc1Δ/Δ、smf3Δ/Δ单基因缺失菌株和mrs4Δ/Δsm/3Δ/Δ、mrs4A/AccclΔ/Δ双基因缺失菌株。研究发现,MRS4基因的缺失会扰乱白念珠菌胞内铁离子稳态,提高细胞膜铁获得相关基因的表达水平,降低线粒体铁利用相关基因的表达水平,从而增强细胞从胞外环境中获得铁的能力,并最终导致胞内铁含量水平的升高。在,nrs4A/A缺失菌株基础上进一步敲除液泡铁转出蛋白Smf3后,会进一步加重胞内铁含量水平的积累,而在mrs4A/A缺失菌株基础上进一步敲除液泡铁转入蛋白Ccc1后,能显著降低胞内铁含量水平,使其恢复至野生型水平。此外,MCS途径在白念珠菌适应性生长、低铁和高铁应答、离子稳态、氧化胁迫、线粒体呼吸、铁硫簇合成、mtDNA稳定性、线粒体膜电势稳定性、细胞壁完整性、抗真菌药物耐受性、形态转换、上皮细胞粘附侵染和毒力等细胞过程中发挥着重要作用。上述结果提示,MCS途径能维持胞内铁离子的稳态,可能作用机理：MCS途径协同调控胞内铁稳态过程,Mrs4负责向线粒体中转入铁以供细胞利用,Ccc1负责向液泡中转入铁以供细胞储存,而Smf3负责将液泡中铁活化释放至胞质中。胞内铁稳态的破坏会严重削弱菌株应答外界环境信号的能力,并导致线粒体功能的失调,从而引发一系列的相互作用的损伤,影响许多重要的细胞过程,如细胞壁完整性、抗真菌药物耐受性、形态发生和毒力等。(3)白念珠菌Aft2转录因子在维持胞内铁稳态过程中具有重要作用。采用原子吸收光谱技术研究发现,AFT2基因的缺失会降低菌株在低铁条件下胞内铁含量水平。Real-Time PCR结果显示,Aft2是一种低铁应答转录因子,具有双重调控作用,既能作为转录激活因子促进FTR1、FET3、FRP1、CFL1和FET34等铁代谢基因表达,也能作为转录抑制因子阻遏MRS4、SIT1、SMF3和HAP43等铁代谢基因的表达。通过定点突变技术和构建LacZ报告质粒方法,研究发现Aft2转录因子能够以基因剂量依赖的方式,通过CACCC保守应答元件负向调控MRS4铁应答基因的表达,从分子水平上初步揭示了Aft2转录因子调控铁代谢基因表达的可能机理。蛋白定位实验表明,在低铁条件下,白念珠菌Aft2转录因子能够从胞浆转运至细胞核内,从细胞水平上提供了Aft2转录因子参与铁代谢基因表达调控的又一证据。(4)除参与调控铁稳态过程外,白念珠菌Aft2转录因子在环境压力应答及形态发生过程中也发挥着重要作用。研究发现,Aft2转录因子以非铁依赖性机制参与氧化压力应答过程。在氧化压力条件下,AFT2基因的缺失导致胞内ROS的聚集,并诱导SOD酶活性,提示生长缺陷可能是由于胞内ROS过度聚集而无法有效清除造成的。采用絮凝实验、疏水性测定以及粘附能力测定实验,发现AFT2基因的缺失影响白念珠菌细胞表面特性,不仅会引起菌株絮凝能力的增强,同时也增强菌株细胞表面的疏水性以及对聚苯乙烯等材料的吸附能力。菌丝诱导实验表明,Aft2转录因子既能作为正向调控因子参与固体诱导条件下的琼脂侵入和形态发生过程,也能作为负向调控因子参与液体诱导条件下的形态发生过程。菌丝诱导信号能够上调白念珠菌AFT2基因mRNA和蛋白表达水平,也能引起Aft2蛋白细胞学定位的改变,使其细胞质中被转运至细胞核内并聚集,为发挥调控作用提供必要条件。在嵌入应答过程中,Aft2转录因子主要作为Czfl途径的下游组分参与激活应答过程,Efg1主要作为负向调控因子抑制Czfl和Aft2的激活活性。免疫共沉淀实验揭示,在YPD正常条件下,Efg1蛋白和Czfl蛋白都能和Aft2蛋白具有物理性相互作用,当诱导信号出现时,Czfl与Aft2蛋白仍然保持相互作用而Efg1与Aft2蛋白间相互作用出现解离。在white-opaque形态转换过程中,Czf1途径可能并不完全依赖于Aft2转录因子,CZF1基因的过表达在一定程度上能够绕开Aft2转录因子,参与未知下游组分的激活,从而促进opaque细胞的形成。本研究发现和鉴定的MCS途径和Aft2转录因子都是重要的毒力决定相关因素,对白念珠菌的生理代谢过程非常重要,为临床抗真菌药物开发以及白念珠菌感染的治疗提供了一个有前景的潜在药物靶点。