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背景阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种进行性的神经系统退行性疾病,也是老年性痴呆中最常见的疾病种类,约占痴呆病因的60-70%,且患者人数呈逐年增加的趋势。AD的致病原因主要是大脑(特别是皮层和海马)的神经元和突触损伤,出现不可逆转的损伤,导致大脑功能区域萎缩从而表现出认知障碍、记忆损害和语言退化等临床特征。该病患者主要病理特征是脑内可见细胞外老年斑、神经纤维缠结以及大量神经元丢失。目前临床上的治疗方法只是短暂有效,只能延缓疾病的进程而不能治愈。因此找到AD早期形成的生物标志物和其病因形成的最终靶标对该病的的早期诊断、早期治疗和对该病的最终铲除具有重要意义。研究资料表明,AD早期即发生嗅觉功能障碍,之后才出现学习和记忆功能的减退,但机制尚不清楚。因此,嗅觉功能障碍可以作为早期诊断和预测AD病程进展的重要指标,也可能成为有效控制和治疗AD的靶点。嗅球作为嗅觉系统的第一级处理中枢,在嗅觉信息的处理过程中发挥重要作用。在嗅球中颗粒细胞层内存在大量的GABA能神经元,可释放抑制性神经递质,在对嗅觉信息的调制过程中起着关键性作用,而这些也会直接影响到嗅觉的传递和记忆,但这些GABA能神经元在AD的病理进程中有何改变及扮演什么角色尚不清楚。本课题感兴趣的是,嗅球颗粒细胞层内的GABA能神经元在AD的病理机制中究竟扮演什么角色?AD小鼠嗅球GABA能神经元形态及功能是否发生变化?以及发生了何种变化?本课题将对此进行探讨。目的1.观察APP/PS1转基因小鼠的认知障碍和嗅觉功能障碍的行为学变化时间。2.研究APP/PS1转基因小鼠嗅球中颗粒细胞的树突棘密度和颗粒细胞和僧帽细胞之间突触形态变化。3.观察APP/PS1转基因小鼠嗅球中颗粒细胞合成及释放GABA能力变化。4.探索AD早期和晚期嗅球外丛状层(external plexiform layer,EPL)中场电位的变化。方法1.利用Morris水迷宫、食物掩埋实验和嗅觉精细分辨实验明确APP/PS1小鼠出现认知障碍和嗅觉功能障碍的时间。2.应用尼氏染色的方法观察APP/PS1小鼠嗅球的层状结构变化。3.采用免疫荧光染色技术观察Aβ在嗅球中的时空分布。4.应用高尔基染色技术,观察APP/PS1小鼠颗粒细胞树突棘密度的变化。5.采用透射电镜观察APP/PS1小鼠嗅球中颗粒细胞和僧帽细胞之间的突触超微结构的变化。6.应用Western Blot技术检测不同年龄阶段的APP/PS1小鼠嗅球中突触相关蛋白的表达水平变化。7.应用荧光定量PCR技术检测不同年龄阶段的APP/PS1小鼠嗅球中GABA合成酶的表达水平变化。8.利用微透析和高效液相色谱联用的方法检测APP/PS1小鼠中颗粒细胞释放GABA的能力变化。9.采用荧光定量PCR技术检测不同年龄阶段的APP/PS1小鼠中GABAA受体mRNA水平变化。10.利用微电极阵列结合药理学的方法,记录APP/PS1小鼠嗅球外丛状层的场电位变化。结果1.APP/PS1转基因小鼠的嗅觉功能障碍发生在3-4月龄,早于认知功能障碍(6-7月龄)出现。2.不同年龄阶段的APP/PS1小鼠嗅球层状结构未发生明显变化。3.APP/PS1小鼠中,随着年龄的增加,Aβ由嗅球的外层逐渐向内层累积,且最终主要在颗粒细胞层中集中过表达。4.在APP/PS1小鼠嗅球中,3-4月龄的颗粒细胞树突棘密度有降低趋势,6-7和9-10月龄时出现显著的树突棘密度降低现象。5.在AD的早期(1-2月龄)颗粒细胞和僧帽细胞之间即出现树-树突触连接结构异常现象;且随着年龄的增长,僧帽细胞与颗粒细胞之间突触结构的异常现象逐渐显著。6.随着年龄的增加,APP/PS1小鼠嗅球内突触相关蛋白PSD95、synapsinI和synaptophysin表达量逐渐降低。7.在APP/PS1小鼠中1-2和3-4月龄时,嗅球内的GAD65的mRNA表达水平升高;6-7和9-10月龄时,嗅球内的GAD65的mRNA表达水平无明显变化;但AD病理进程中GAD67的mRNA表达水平未发生显著变化。8.1-2月龄的APP/PS1小鼠中嗅球颗粒细胞释放的GABA水平较正常水平高;从3-4月龄开始,APP/PS1释放的GABA水平与正常水平相比无显著差异。9.与同年龄阶段的c57小鼠相比,在APP/PS1小鼠中GABAAα1和α2受体的mRNA水平高;1-2和3-4月龄APP/PS1小鼠嗅球中α3受体mRNA表达水平显著升高,6-7和9-10月龄时无明显差异;1-2月龄的APP/PS1小鼠嗅球中α5和gephyrin的mRNA表达水平显著升高,但3-4、6-7和9-10月龄时表达量趋于平稳,和正常水平无明显差异。10.1-2月龄的APP/PS1小鼠嗅球外丛状层的γ波振荡未出现显著变化;给予GABAA受体激动剂muscimol刺激后,也未出现明显变化。11.9-10月龄时嗅球外丛状层的γ波振荡异常增强;给予GABAa受体激动剂muscimol刺激后,外丛状层的γ波振荡减弱。结论1.在阿尔兹海默病的早期即出现嗅觉功能障碍,且早于认知功能障碍的出现。2.随着年龄的增加,AD小鼠中Aβ表达量逐渐升高;在嗅球中从外部逐渐向内部累积,最终主要在颗粒细胞层内集中表达。3.APP/PS1小鼠中嗅球颗粒细胞的树突棘和突触结构形态出现异常,且随着年龄的增加,该形态学异常现象逐渐加剧。4.在AD早期,APP/PS1小鼠颗粒细胞合成并释放GABA的水平明显较正常c57小鼠升高,而AD后期,APP/PS1小鼠颗粒细胞合成并释放GABA的水平和正常小鼠相比无明显差异。5.在AD早期嗅球外丛状层中γ波振荡正常,后期Y波振荡异常增强。