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现如今,基质辅助激光解吸离子化（MALDI）质谱技术已经成为蛋白组学领域必不可少的分析工具。尽管MALDI技术已广泛使用,然而,MALDI质谱在实际样品分析工作中仍然存在着许多挑战和不足:1、一些与疾病相关的标志蛋白往往在体内是低表达,使用质谱检测低丰度蛋白一直以来是个极大的挑战;2、MALDI质谱对于有些分析物（如膜蛋白）具有较低的离子化效率;3、生物样品中大量的盐、离液剂或表面活性剂等添加物会对质谱分析产生较严重干扰,导致差的分析重现性和检测灵敏度;4、一些样品前处理方法往往操作繁琐、成本较高,在高通量分析上受到了较大的限制;5、MALDI质谱在小分子区域具有较大的背景干扰,在小分子分析物的检测中谱图识别和灵敏度上无法达到分析要求;6、MALDI质谱较难实现对分析物的定量分析。本论文针对以上MALDI检测上存在的几大难题,通过文献的调研,提出了相应的解决方案。本文从MALDI有机小分子基质的研发、MALDI靶板图案化修饰和MALDI蛋白酶分子探针设计的角度出发,在研究生期间做了如下四个工作:1.这里我们合成了一系列α-氰-4-羟基肉桂酸（CHCA）羧基烷基链酯化的衍生物并评价它们作为MALDI蛋白分析基质的表现。在这些合成的衍生基质当中,（E）-丙基α-氰-4-羟基肉桂酸盐（CHCA-C3）表现出对完整蛋白分子检测最佳的表现。同传统基质super 2,5-二羟基苯甲酸、芥子酸和CHCA相比,其检测灵敏度提升了一个数量级。此外,CHCA-C3展现出高耐盐性,在出现8 M尿素、2 M NH4HCO3和500 mM KH2PO4时很容易检测到马肌红蛋白的离子信号。同时CHCA-C3表现出高耐洗性。这些分析表现的提升主要归因于CHCA-C3基质激光消融能力的提升以及与蛋白分子间疏水亲和力的增加,这使得分析物能够更好的离子化。鸡蛋清分析实验进一步表明CHCA-C3基质能够有效的对复杂样品中低丰度蛋白进行检测。这些突出的分析表现表明CHCA-C3基质在MALDI质谱对完整蛋白测定中具有很大的潜力。2.尽管膜蛋白在生物系统中的重要性毋庸置疑,然而它们特殊的性质使得它们很难被分析。目前广泛使用的MALDI质谱偏向于分析亲水性的胞浆蛋白,而对于疏水膜蛋白的离子化效率很低。这里,我们评价了疏水的CHCA-C3用作耐污染物基质用于膜蛋白的高灵敏分析。相对于CHCA,使用CHCA-C3基质对疏水肽的检测限提升了10倍到100倍。此外,在高浓度离液剂、盐和去污剂以及人尿液和血清样品环境时,使用CHCA-C3依然可以获得高质量的谱图信息。同时,CHCA-C3在出现这些污染物时可以实现均匀的样品分布。高污染物耐受性应该要归因于CHCA-C3提升的疏水性,该基质分子对亲水性的污染物具有较低的亲和力。我们进一步使用CHCA-C3分析了胰酶酶切和CNBr切割的含有七个跨膜区域的菌视紫红质膜蛋白。CHCA-C3大大提升了膜蛋白跨膜区域可鉴定的蛋白数量和序列覆盖率（高达100%）。此外,我们对膜蛋白溶剂和靶板材料做了优化筛选,使用结合后的方法可以实现完整膜蛋白的高灵敏检测,相对传统方法提升三个数量级以上。3.我们开发了一种新型的靶上图案化方法,该方法无需昂贵的材料和化学反应即可直接在MALDI钢靶上制作环形的疏水石蜡-亲水钢-疏水聚苯乙烯图案化结构,实现了多肽和蛋白样品的一步原位自除盐和富集（OISE）。OISE靶板能够有效地将盐和分析物、基质隔离开,而同时将分析物和基质进行浓缩,随后在中央的聚苯乙烯涂层上可以形成均匀的共晶结构。即使样品中出现高浓度的盐（200 mM NH4HCO3,1 M NaCl或400 mM尿素）,使用OISE靶板依然可以获得高质量和重现性的谱图。我们使用这个方法成功的分析了BSA酶切产物和人血清样品,进一步表明了该方法的实际应用潜力。4.γ-谷氨酰转肽酶（GGT）在维持细胞内谷胱甘肽/半胱氨酸的体内平衡中扮演着重要作用,是一个潜在的恶性肿瘤标志物。这里,我们首次合理设计了一个水溶性GGT特异性的MALDI肽段探针Aq-ECG用于GGT活性的监测。该探针由作为识别单元的谷胱甘肽和带有紫外吸收的芳香蒽醌发生Michael加成反应即可制得。在出现GGT时,探针的谷酰基基团发生特异性碎裂,我们使用一个非同位素内标（与探针分子相差一个甲基）对探针进行准确地定量。该探针和内标具有高离子化能力和高质量的MALDI谱峰,避免了小分子基质的干扰和源内碎裂。使用优化后的探针方法可以实现在GGT活性1?50 U/L范围内的准确定量。该方法对GGT抑制剂阿西维辛的IC50值进行了测定。我们进一步合成了磁性氧化石墨烯实现了对复杂样品中探针分子和内标的选择性捕获,避免了复杂的样品前处理过程。作为结果,该探针方法可实现对人血清和细胞溶菌产物中GGT水平的快速和准确检测。本实验方法设计合理、简单、有效,通过与高通量的MALDI技术相联用,在蛋白酶活性研究中表现出巨大的分析应用能力。