肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）为主的原发性肝癌在全世界恶性肿瘤的发病率居第六位,死亡率居第四位,放射治疗作为HCC重要的局部治疗手段已广泛应用于临床。临床实际治疗中由于大部分HCC患者病灶体积较大,并且HCC常伴有乏氧坏死组织显著降低了辐射敏感性;国内患者大多伴有慢性病毒性肝炎、肝硬化等基础肝脏疾病,导致正常肝细胞组织对射线的耐受性差;肝癌病灶周围的脊髓、胃和小肠等均属于对辐射敏感的器官,临床上难以给予根治性的放疗剂量。上述原因最终导致放疗疗效不理想。因此,围绕HCC在乏氧条件下的能量代谢和辐射抗性的调控机制的进行研究,有助于提高HCC局部放疗疗效,并为靶向治疗提供新的分子靶点。研究背景:电离辐射通过间接诱发氧自由基诱导肿瘤细胞DNA的单链及双链损伤杀伤肿瘤细胞。肿瘤微环境的乏氧导致肿瘤细胞的活性氧和氧自由基显著减少,导致辐射抗性的发生。肿瘤细胞即使在氧供应充足和线粒体功能正常的情况下,仍然采用有氧糖酵解的方式摄取葡萄糖转化为乳酸,而不利用氧化磷酸化的方式供能,这种的现象叫做瓦伯格效应,是恶性肿瘤细胞能量代谢的主要特征。有氧糖酵解中的代谢产物如乳酸、丙酮酸、谷胱甘肽和NADPH等酸性物质累积,这些氧化还原剂可高效地清除活性氧和氧自由基,上调了内源性抗氧化能力,进一步导致了辐射抗性的发生。micro RNA是肿瘤发生和发展的重要调控因子,众多学者发现mi R-873在胶质母细胞瘤、结直肠癌和肺腺癌等不同的恶性肿瘤中异常表达,通过靶向调控不同的靶基因发挥癌基因或抑癌基因的作用。文献报道mi R-873可参与NF-κB、ERK、PI3K/AKT和Wnt/β-catenin等多种信号通路的调控。然而,mi R-873在HCC发生发展中的表达情况以及在HCC能量代谢和辐射抗性关系等生物学功能方面尚未见报道。研究目的:肿瘤细胞通过瓦伯格效应维持自身的快速持续增殖,并促进辐射抗性的发生。阐明乏氧微环境中HCC的能量代谢和辐射抗性的分子调控机制,对提高HCC局部放疗疗效具有重要的意义。研究方法:基于以上研究现状,本研究首先检测了86对HCC组织样本（肿瘤组织和癌旁组织）中的mi R-873表达,并与临床信息的相关性进行统计学分析。采用细胞增殖、迁移和侵袭实验探讨mi R-873在HCC的生物学功能。通过细胞克隆形成实验、MTT、流式细胞术等方法探讨mi R-873对HCC辐射抗性的影响。通过糖代谢相关实验和气相色谱质谱（GC-MS）分析法追踪¹³C标记的葡萄糖的代谢产物通量等方法对mi R-873能量代谢途径和相关指标进行分析、阐明其与瓦伯格效应的关系。应用公共mi RNA数据库进行预测其调控的靶基因为NDFIP1,并应用荧光素酶报告基因、q RT-PCR和免疫组化等方法进行研究其二者的靶向调控关系。通过gain-and-loss方法重复上述实验证实NDFIP1在HCC发生发展中的生物学功能与瓦伯格效应的关系。应用Western Blot、q RT-PCR、IHC等方法从体内、外实验检测其上、下游的调控信号通路分子。研究结果:1.体内、外检测mi R-873在HCC中表达水平及与临床信息的相关性分析（1）mi R-873在HCC组织中的表达与临床信息的相关性本研究收集了86对HCC患者的肿瘤和癌旁组织,检测mi R-873的表达,并深入分析HCC中mi R-873的表达水平与患者基本信息、肿瘤相关指标和临床预后等信息（患者年龄、性别、肿瘤大小、病理分级、临床分期、淋巴血管转移、生存期和复发时间等临床治疗预后情况）的相关性,统计学分析了HCC中mi R-873表达的临床意义。结果显示,肝癌组织中的mi R-873呈高表达,明显高于癌旁组织。而且mi R-873的表达量与肿瘤临床分期、淋巴结转移及远处转移等恶性程度呈正相关,与肿瘤分化程度呈负相关,并且与HCC患者生存期和复发时间呈负相关,多因素分析显示HCC的临床分期和mi R-873的表达高低为预后的不良因素。（2）mi R-873在肝癌细胞和正常细胞的表达采用q RT-PCR方法检测了5种肝癌细胞系（SMMC-7721、Hep G2、Hep3B、SKHEP-1、MHCC97H）和3种人正常肝细胞系（L02、7701、7702）中mi R-873的表达水平,得出与正常肝细胞系相比,肝癌细胞系中的mi R-873均呈高表达（p<0.01）。综上得出mi RNA-873在HCC中作为癌基因可能发挥重要作用。2.探讨mi R-873在HCC中的生物学功能（1）过表达mi R-873基因对HCC增殖、迁移和侵袭的影响通过逆转录病毒转染法,将mi R-873 mimics转染到SMMC-7721细胞中,构建稳定mi R-873过表达的SMMC-7721细胞系（SMMC-7721-mi R-873high）,经q RT-PCR法验证转染成功后,通过CCK-8和Transwell实验对其增殖、迁移和侵袭能力进行检测。结果分析发现,与SMMC-7721-NC细胞相比,SMMC-7721-mi R-873 high细胞具有较强的增殖、迁移和侵袭能力（p<0.01）。（2）抑制mi R-873基因对HCC增殖、迁移和侵袭的影响通过逆转录病毒转染法,将mi R-873 inhibitor#1和#2分别转染到Hep3B细胞中,构建稳定mi R-873低表达Hep3B细胞系（Hep3B-anti-mi R-873-#1和Hep3B-anti-mi R-873-#2）,经q RT-PCR法验证转染成功后,同样通过CCK-8和Transwell实验检测两种mi R-873低表达的Hep3B细胞和正常Hep3B细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结果显示:与Hep3B-NC细胞相比,两种mi R-873低表达的Hep3B细胞均显著抑制了细胞的增殖、迁移和侵袭能力（p<0.01）。综合上述实验结果得出,mi R-873在HCC中作为癌基因,具有促进HCC增殖、迁移和侵袭的生物学功能。3.探讨miR-873对HCC辐射抗性的影响（1）过表达mi R-873对HCC辐射抗性的影响在SMMC-7721细胞中转染mi R-873的mimics过表达mi R-873,给予10 Gy的X线照射后24和48 h,经MTT法检测细胞增殖能力,结果显示,与转染NC对照组相比,过表达mi R-873的SMMC-7721细胞存活率升高约15%（p<0.05）。给予0、1、2、4、6、8 Gy的X线照射后细胞克隆形成实验,结果显示,过表达mi R-873的SMMC-7721细胞存活分数显著增加,应用流式细胞术检测经6 Gy X线照射的过表达mi R-873的SMMC-7721细胞,结果显示,细胞凋亡率明显降低（p<0.01）。表明过表达mi R-873可产生辐射抗性。（2）抑制mi R-873表达对HCC辐射抗性的影响在Hep3B细胞转染anti-mi R-873抑制mi R-873的表达,给予10 Gy的X线照射后24和48 h,经MTT法检测细胞增殖能力,结果显示,与转染anti-NC相比,mi R-873低表达的Hep3B细胞存活率下降约15%（p<0.05）。给予0、1、2、4、6、8 Gy的X线照射后细胞克隆形成实验得出抑制mi R-873的Hep3B细胞存活分数显著降低。应用流式细胞术检测经6 Gy X线照射的抑制mi R-873的Hep3B细胞的凋亡情况,结果显示,细胞凋亡率明显增加,并且细胞周期发生G2/M期阻滞（p<0.05）。表明抑制mi R-873表达可降低HCC的辐射抗性。综上实验结果证明,在HCC中过表达mi R-873产生辐射抗性,而抑制mi R-873可明显降低HCC的辐射抗性。4.探讨mi R-873在HCC中对糖代谢的调控功能（1）过表达或抑制mi R-873对HCC糖代谢的影响通过检测细胞外酸化率（ECAR）、耗氧率（OCR）、葡萄糖的摄取量、乳酸的产生量等糖代谢的指标进行分析。结果显示:抑制mi R-873基因表达的Hep3B细胞基础ECAR和最大ECAR均显著降低,而OCR显著升高（p<0.01）,葡萄糖的摄取和乳酸的产生量均呈降低趋势（p<0.05）。同理,在SMMC-7721细胞中转染mimics过表达mi R-873并对上述糖代谢指标检测,结果显示,过表达mi R-873后ECAR、葡萄糖摄取和乳酸产生量均呈升高趋势（p<0.01）,而OCR降低（p<0.01）。综上结果得出,mi R-873增强HCC的糖代谢能力。（2）研究mi R-873参与调控HCC有氧糖酵解采用气相色谱-质谱分析法（GC-MS）追踪过表达mi R-873的SMMC-7721细胞中¹³C标记的葡萄糖的代谢通量。结果显示:过表达mi R-873的SMMC-7721细胞培养基中¹³C标记的葡萄糖水平显著降低,¹³C标记的细胞内和细胞外乳酸水平升高（p<0.05）,过表达mi R-873后促进了HCC的有氧糖酵解。同时,检测到¹³C标记的葡萄糖-6-磷酸（G6P）、1,6-二磷酸（F1,6BP）和磷酸烯醇丙酮酸（PEP）等糖酵解的中间代谢产物水平升高,而三羧酸循环（TCA）的中间代谢产物柠檬酸、琥珀酸、富马酸和苹果酸的水平降低（p<0.05）,综上结果表明,mi R-873在HCC中促进有氧糖酵解,而非氧化磷酸化。5.mi R-873的调控靶基因及其生物学功能（1）预测并验证mi R-873的靶基因1)生物信息学预测mi R-873调控的靶基因采用公共mi RNA数据库（Target Scan、mi Randa、Target Rank）通过与糖酵解相关的3’-UTRs基因位点进行预测mi R-873的靶基因为NDFIP1。通过将含有mi R-873靶位点的NDFIP1的3’-UTR克隆到荧光素酶报告基因载体中,利用荧光素酶报告基因验证两者之间具有靶向关系。2)研究mi R-873对NDFIP1的调控作用利用不同浓度的pre-mi R-873瞬时转染HEK293T细胞后,应用Western Blot检测内生NDFIP1蛋白的水平,结果表明mi R-873转染量与NDFIP1呈负相关（p<0.01）。采用q RT-PCR和免疫组化染色检测了20对临床HCC样本中mi R-873和NDFIP1的表达情况,得出HCC中NDFIP1 m RNA水平显著低于癌旁组织,并发现在HCC中mi R-873的表达与NDFIP1呈负相关（p=0.008）。（2）探讨NDFIP1作为mi R-873的靶基因对HCC糖酵解的影响在SMMC-7721细胞中过表达mi R-873和（或）NDFIP1后进行上述糖代谢相关检测,实验分为四组（NC、mi R-873、mi R-873+vector、mi R-873+NDFIP1）。结果显示,通过检测ECAR、OCR、葡萄糖的摄取量、乳酸的产生量等指标,发现过表达mi R-873后可增强有氧糖酵解,但同时过表达NDFIP1后可明显降低由过表达mi R-873而增强的糖酵解能力（p<0.01）,结果证明mi R-873通过抑制NDFIP1来促进有氧糖酵解。（3）探讨NDFIP1作为mi R-873的靶基因在HCC中的生物学功能通过gain-and-loss实验探究NDFIP1在HCC增殖、迁移和侵袭的生物学功能。在SMMC-7721细胞中转染p CDH-CMV-NDFIP1使其过表达,通过细胞增殖实验和Transwell实验结果显示,与SMMC-7721-NC细胞相比,过表达NDFIP1的SMMC-7721细胞显著减弱了增殖、迁移和侵袭能力（p<0.01）。在SMMC-7721细胞中同时过表达NDFIP1和mi R-873,通过细胞增殖实验和Transwell实验检测结果显示,同时过表达这两个基因的SMMC-7721细胞较单独过表达mi R-873的SMMC-7721细胞显著减弱了增殖、侵袭和迁移能力（p<0.01）。在Hep3B细胞中同时应用si RNA抑制NDFIP1和anti-mi R-873抑制mi R-873的表达,并通过细胞增殖实验和Transwell实验检测结果显示,同时抑制两个基因表达的Hep3B细胞较单独抑制mi R-873的Hep3B细胞可显著增强细胞的增殖、迁移和转移的能力（p<0.01）。这些结果提示,mi R-873通过抑制NDFIP1的表达来发挥促进HCC增殖、迁移和侵袭的癌基因的生物学功能。6.阐明mi R-873/NDFIP1调控瓦伯格效应的信号通路机制采用Western Blot检测HIF-1α、c-Myc、AKT-s473和S6K等调控糖代谢信号通路的关键蛋白的表达。结果显示,与对照组相比,过表达mi R-873的SMMC-7721细胞中HIF-1α、c-Myc和总AKT水平无变化,但可诱导AKT-s473和S6K磷酸化。应用PI3K特异性抑制剂（LY294002）处理过表达mi R-873的SMMC-7721细胞,经过Western Blot检测相关蛋白表达,结果显示,LY294002显著抑制AKT磷酸化,同时降低了mi R-873诱导增强的糖酵解途径中关键酶Glut1和HK2的表达（p<0.01）。m TOR抑制剂（雷帕霉素）和LY294002均可抑制mi R-873过表达的SMMC-7721细胞中葡萄糖摄取和乳酸产生量的增加（p<0.05）。综上数据表明,AKT或m TOR的激活是mi R-873诱导有氧糖酵解所必需的,证明其下游调控信号通路为AKT/m TOR信号通路。7.阐明mi R-873在HCC中的上游调控分子机制使用q RT-PCR检测在Co Cl2模拟缺氧条件下HCC中mi R-873表达。结果显示,应用Co Cl2处理后会显著上调SMMC-7721和Hep3B细胞中mi R-873的m RNA表达水平（p<0.01）。在上述两种细胞中首先分别转染两种si-HIF-1α降低HIF-1α的表达,再应用同样的Co Cl2处理后,应用q RT-PCR检测mi R-873的m RNA的表达量,发现mi R-873的表达显著下调（p<0.05）。进一步阐明HIF-1α如何调控mi R-873的表达,我们使用mi RStart和JASPAR数据库预测mi R-873的TSS和HRE,发现HIF-1α与mi R-873中TSS上游的-1kb序列区中HREs结合。因此,将含有预测HRE序列的mi R-873（-1 kb）启动子区域克隆到p GL3载体中。同样用COCl2处理HEK293T细胞后mi R-873启动子荧光素酶活性增加,而转染si-HIF-1α后明显降低荧光素酶活性（p<0.01）。应用裸鼠皮下移植瘤实验进一步研究HIF-1α对mi R-873的调控作用。利用HIF-1α特异性抑制剂（BAY87-2243）对Hep3B皮下移植瘤的雄性BALB/c裸鼠连续灌胃15天后处死小鼠,用q RT-PCR法检测肿瘤组织mi R-873的m RNA表达水平和IHC法检测HIF-1α蛋白的表达。结果显示,与对照组小鼠相比,经BAY87-2243处理的小鼠mi R-873的m RNA表达量显著降低（p<0.01）,IHC显示HIF-1α蛋白的表达显著减少。结论:1.mi R-873在HCC中高表达,与HCC恶性程度呈正相关,与临床预后呈负相关。2.mi R-873作为癌基因发挥促进HCC增殖、迁移和侵袭的生物学功能;3.过表达mi R-873产生辐射抗性,靶向抑制mi R-873可显著降低HCC的辐射抗性,有利于提高HCC的放射敏感性;4.mi R-873通过增强HCC有氧糖酵解同时抑制氧化磷酸化,进而增强瓦伯格效应;5.NDFIP1是mi R-873的靶基因,作为抑癌基因,发挥抑制HCC增殖、迁移、侵袭和瓦伯格效应的生物学功能;6.mi R-873/NDFIP1轴通过AKT/m TOR信号通路增强了HCC的瓦伯格效应,进而促进HCC的生长和转移;7.在HCC乏氧微环境中,引起HIF-1α的过表达后上调了mi R-873的表达,进而调控瓦伯格效应的发生,促进HCC增殖、迁移、侵袭和辐射抗性的发生。