胰岛素是人体内唯一降低血糖的激素，对于糖尿病的治疗特别是抑制并发症至关重要。但目前胰岛素的使用面临注射次数频繁，低血糖风险，患者体重增加等诸多问题。为减少频繁地注射胰岛素给糖尿病患者带来诸多的不便和痛苦，同时降低低血糖事件，特别是夜间低血糖事件，临床需要降糖有效时间更长且药物代谢更平稳的长效胰岛素类似物。本研究将去B链第30位苏氨酸（Thr）的天然人胰岛素(代号：DesB³⁰)与分子量不同（5kDa、10kDa、20kDa、40kDa）的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯（mPEG-succinimidyl propionate，mPEG-SPA）进行酰化反应,形成一系列与B链第29位赖氨酸单一位点修饰的胰岛素偶联物(代号： PEG-DesB³⁰-5kDa、PEG-DesB³⁰-10kDa、PEG-DesB³⁰-20kDa、PEG-DesB³⁰-40kDa)。通过对这些分子量不同的胰岛素偶联物进行工艺、药效、药代、安全性比较分析，最后筛选出制备工艺简单、降糖时间长、安全性最高、质量可控的结构PEG-DesB³⁰-20kDa。研究目的：通过对重组人胰岛素的聚乙二醇修饰，实现其降糖有效时间长且药物代谢平稳的目标，为新的长效胰岛素类似物药物的研发提供依据。本论文在前期结构筛选研究的基础之上，重点对PEG-DesB³⁰-20kDa进行结构和修饰位点确认；对蛋白含量进行标定；在此基础上对PEG-DesB³⁰-20kDa进行体内外生物效价测定。获得结构均一、质量可靠的样品，为临床研究提供可靠的结构及质量依据。研究方法：①通过氨基酸组成分析、N-末端氨基酸序列测定、质谱分子量测定、圆二色谱测定、二硫键构成分析、质谱肽谱分析等手段，确定PEG-DesB³⁰-20kDa的一二级蛋白结构。通过修饰前后质谱肽谱图谱对比分析和修饰肽段氨基酸组成分析，确认PEG修饰位点。②利用Lowry法、紫外吸收法、凯氏定氮法对PEG-DesB³⁰-20kDa进行含量标定，对标定结果进行比较分析。以凯氏定氮法标定结果为标准，评估其它两种方法标定结果的偏差，确定一种准确而又简单的蛋白浓度测定方法。③在确认PEG-DesB³⁰-20kDa结构正确，准确标定其蛋白含量的基础之上，采用体内小鼠双交叉法和体外胰岛素受体结合法，测定PEG-DesB³⁰-20kDa的生物效价。研究结果：①PEG-DesB³⁰-20kDa的氨基酸组成、N-末端氨基酸序列、质谱分子量以及圆二色谱的测定值与理论值一致；三对二硫键（CysA6-CysA11、CysA7-CysB7、CysA20-CysB19）配对正确；聚乙二醇的修饰位点为B链第29位赖氨酸（Lys）；样品结构正确、均一，质量可控。②凯氏定氮法、Lowry法、紫外吸收法对分装的PEG-DesB³⁰-20kDa样品进行含量标定，结果分别为1.02mg/ml、1.14mg/ml、1.03mg/ml。与凯氏定氮法比较，Lowry法测定结果偏差大于10.0%，紫外法测定结果偏差小于5.0%。因此，选用定氮法和紫外吸收法作为PEG-DesB³⁰-20kDa的蛋白含量标定方法，PEG-DesB³⁰-20kDa平均蛋白含量1.025mg/ml。③采用体内小鼠双交叉法和体外胰岛素受体结合法，测定PEG-DesB³⁰-20kDa的生物效价分别为8.39U/mg、8.04U/mg。结论：PEG-DesB³⁰-20kDa的一二级蛋白结构正确，聚乙二醇的修饰位点为B链第29位赖氨酸（Lys）。聚乙二醇修饰后生物活性降低，其生物效价约为8.39U／mg。获得的样品结构正确、均一，药效持续时间达到48h以上，代谢平稳，将成为具有临床意义的长效胰岛素类似物。