【摘 要】
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目的利用酵母双杂交技术了解Sedlin/PAM14（protein associated with MRG, 14kD）之间的相互作用,并构建PAM14缺失突变体以及Sedlin的点突变体,研究它们在酵母中的相互作用的具体位点。构建带GFP标签的Sedlin的表达载体和带HA标签的PAM14的表达载体,将其共转染至COS7细胞,观察其在细胞内的共定位的具体情况。方法以含人PAM14全长cDNA序列
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目的利用酵母双杂交技术了解Sedlin/PAM14（protein associated with MRG, 14kD）之间的相互作用,并构建PAM14缺失突变体以及Sedlin的点突变体,研究它们在酵母中的相互作用的具体位点。构建带GFP标签的Sedlin的表达载体和带HA标签的PAM14的表达载体,将其共转染至COS7细胞,观察其在细胞内的共定位的具体情况。方法以含人PAM14全长cDNA序列的质粒pCDNA3.1-PAM14为模板,用PCR方法扩增PAM14的cDNA序列,用限制性内切酶酶切PCR产物,回收目的片段,连接到酵母系统2提供的载体pACT2上,构建表达载体pACT2-PAM14。用相似的方法构建pCDNA3.1-HA-PAM14,pCDGFP-Sedlin。用SmaⅠ把PAM14酶切为两段（N端254bp,编码84个AA,标记为PAM14-N）,回收酶切的N端,连接到pACT2上,构建成PAM14的缺失突变体pACT2-Pam14-N。用PCR的方法构建PAM14的另一缺失体pACT2-Pam14-C（编码43个AA）。以pAS-Sedlin为模板,构建Sedlin定点突变（S124A）质粒pAS-SedlinS。以两条含有突变位点的互补序列为引物进行PCR扩增,将得到的PCR产物用DpnⅠ酶切除去模板,消化产物转化大肠杆菌感受态DH5α,对得到的阳性克隆进行测序。把构建的酵母表达载体分成三组转化酵母感受态,检测它们相互作用的情况。将pACT2/pAS-Sedlin, pACT2/pAS-Sedlin-N, pACT2-PAM14/pAS-Sedlin, pACT2- PAM14/pAS-Sedlin-N等质粒分别共转化入酵母菌Y190,再通过滤膜印迹实验测定β-半乳糖苷酶活性。呈蓝色的克隆是两种蛋白可能相互作用的阳性克隆。将pACT2/pAS-Sedlin, pACT2-PAM14/pAS-Sedlin, pACT2-PAM14-N/pAS-Sedlin, pA- CT2-PAM14-C/pAS-Sedlin等质粒分别共转化入酵母菌Y190,再通过滤膜印迹实验测定β-半乳糖苷酶活性。呈蓝色的克隆是两种蛋白可能相互作用的阳性克隆。将pACT2/pAS-Sedlin, pACT2-PAM14/pAS-Sedlin, pACT2-PAM14/pAS-SedlinS等质粒分别共转化入酵母菌Y190,研究它们在酵母中的相互作用情况。将构建正确的质粒pCDNA3.1-HA-PAM14, pCDGFP-Sedlin共转染COS7细胞,制作免疫荧光片,在荧光显微镜下观察它们在细胞内的定位。根据荧光片观察的结果分析,初步判断它们共定位于核仁。将pCDNA3.1-HA-PAM14, pCDGFP-Sedlin共转染至HEK 293T细胞,培养48 h,用蔗糖密度梯度离心法提取核仁。将得到的核仁制作成免疫荧光片分析并进行western blot分析。结果构建了突变体pAS-SedlinS;营养筛选和β-半乳糖苷酶活性测定均表明共转化入Y190的质粒中,仅pACT2-PAM14/pAS-Sedlin, pACT2-PAM14-N/pAS-Sedlin, pACT2-PAM14/pAS-SedlinS等为阳性,其余几组均为阴性; pCDNA3.1-HA-PAM14和pCDGFP-Sedlin在COS7细胞中共定位于细胞核。将pCDNA3.1-HA-PAM14, pCDGFP-Sedlin转染至HEK 293T细胞,用蔗糖梯度离心法提取核仁,免疫荧光片观察发现,在核仁中存在两者的共定位。Western blot分析,两者同样存在于提取的核仁沉淀中。结论应用酵母双杂交系统2验证了Sedlin与PAM14之间的相互作用;PAM14氨基端的84个氨基酸残基对于Sedlin与PAM14的相互作用是必需的,Sedlin羧基端S124位氨基酸残基对于它们的相互作用不是必需的。Sedlin与PAM14在HEK 293T细胞中是相互作用的,并且两者在COS7细胞中共定位于核仁。
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