几种抗稻瘟病生防菌的活性及其物质基础

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水稻是世界主要的粮食作物,全球有超过一半的人以大米为主食。稻瘟病的发生严重影响了水稻的生产。目前稻瘟病的防治主要依靠选育抗病品种和化学农药的手段,由于稻瘟病菌易发生变异,生理小种繁多,选育抗病品种需要较长时间等原因,抗病品种应用也收效甚微;传统的化学农药防治虽见效快,但长期使用化学农药对人畜健康和生态环境安全造成隐患。生物农药具有对环境友好、无残留等特性是农业可持续发展、生态环境保护及食品安全保障的重要选项。本论文基于课题组前期积累的8株生防菌,通过平板对峙法和生防活性(菌株的遗传稳定、菌株发酵液的耐酸碱、耐高温、抗紫外线等)评价,明确活性菌株;通过大量发酵富集菌株次级代谢产物,并进行单体化合物提纯分离,明确活性菌株的物质基础。具体结果如下:1、明确候选菌株平板对峙法初步筛选活性菌株。为了筛选获得具有抗稻瘟病的活性菌株,利用课题组前期获得了8株生防菌株(嗜麦芽寡养假单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)he41、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)F2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)H3、缺陷假单胞菌(Brevundimonas bullata)hd13、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis)he14、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)D1、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)hd213、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)DEB-2)进行平板对峙筛选。结果发现菌株D1、he41、he14对三种稻瘟病菌生理小种生长抑制均大于61%,H3次之,抑制率〉57.6%,F2最低,抑制率为〉54%,其余3种均无明显抑制作用。为更进一步明确菌株的活性,将具有活性的菌株进行发酵培养,通过对基础培养基中添加发酵液,检测其对稻瘟病菌的抑制率,结果发现当发酵滤液浓度达到32%时,菌株D1、he41、he14、H3的无菌发酵滤液对三种稻瘟病菌生理小种的菌丝抑制率均达90%以上,抑菌效果显著,当发酵液浓度为64%时,菌株D1、he14、H3、he41的无菌发酵滤液均能抑制稻瘟病菌的生长,抑制率达100%,由此表明菌株D1、H3、he41、he14对稻瘟病菌生理小种ZB7、ZC11、ZG1具有明显的抑制作用。菌株生防活性评价。为了探究候选生防菌株是否具有开发为生防菌剂的潜力,因此对菌株D1、H3、he41、he14进行了活性的遗传稳定、抗紫外线稳定、耐高温、耐酸碱及菌株he41的温室防效实验,结果显示,(1)菌株D1、he41、he14、H3经转接培养30次,所有的生防菌对三种稻瘟病菌的抑菌率都在70%~100%之间。(2)将菌株D1、he41、he14、H3的发酵液经p H值3~11的条件处理后,抑菌率为51%至95%,在紫外灯(30W)下照射6 h后,发酵液抑菌率仍达到75%至95%之间,经121℃高温处理后,菌株he14无菌发酵滤液的抑菌率65%至82%,而菌株D1、he41、H3发酵液经40℃处理后对稻瘟病菌则无抑制作用。用胰蛋白酶和蛋白酶K对菌株D1、he41、he14、H3的无菌发酵滤液进行检测,发现菌株D1、he41的发酵液中可能存在部分抗菌蛋白类物质。(3)用菌株he41的菌体对稻瘟病进行苗叶瘟防治,当菌体浓度为4×109cfu/ml时温室防效略高于生物农药枯草芽孢杆菌防效,生物农药防效为25.27%,菌株he41的防效为29.79%。由此表明,菌株D1、he41、he14、H3均具有针对稻瘟病开发生防菌剂的潜力。2、单体化合物分离为了明确活性菌株抗菌的物质基础,本论文选取了活性最好的he41菌株进行了发酵产物的化合物分离。通过TLC实验筛选、反复常压硅胶柱层析等方法,一共分离获得了4个单体化合物和一个混合物。通过核磁共振(NMR)波普分析、质谱(MS)分析鉴定了4个已知化合物,分别为化合物1:吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮,六氢-3-(2-甲基丙基),化合物2:3-异丁基-6-甲基-2,5-哌嗪二酮,化合物3:3-异丁基-6-(丙-2-基)哌嗪-2,5-二酮,化合物4:3,6-二-(2-甲基丙基)-2,5-哌嗪二酮。为了明确分离获得的单体化合物是否具有抗病活性。将单体化合物及混合物进行了抗真菌活性筛选,结果发现只有化合物1对水稻纹枯病有微弱的抑菌活性,混合物对稻瘟病菌及猕猴桃褐腐病具有抑制作用,由此表明菌株he41的代谢产物还有待继续探索。
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