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鸭圆环病毒(Duck circovirus, DuCV)是圆环病毒科的成员之一,主要侵害鸭免疫系统使其发生免疫抑制,其基因组由多个ORF组成,其中ORF1主要编码Rep蛋白(Replication protein,复制蛋白),该蛋白与病毒复制有关。而糖基化在蛋白翻译后有重要的修饰和调节蛋白质功能的作用。本研究通过DuCV Rep蛋白N-糖基化位点的突变来探究Rep蛋白对病毒增殖与致病性的影响。1. DuCV Rep蛋白N-糖基化位点突变株的构建以本实验室已构建的双拷贝克隆株(已引入与病毒复制调控区域无关的酶切位点Xho Ⅰ)为模板,利用重叠PCR的方法针对Rep蛋白N-糖基化位点(即Rep蛋白第6位与第18位氨基酸)进行突变,获得的突变株W-6 (Rep蛋白第6位氨基酸突变株)和W-18 (Rep蛋白第18位氨基酸突变株)并通过免疫雏鸭来检验拯救效果。结果显示：在接种后第1d、2d未在血清中扩增出DuCV目的片段,但第4d在雏鸭血清中检出DuCV目的片段,表明扩增产物不是直接来源于动物接种的突变DNA,后经测序确认在血清中所抽提的DNA含有改造的Xho Ⅰ酶切位点,显示所构建的该病毒突变株已在鸭体内成功环化并增殖。2. DuCV Rep蛋白N-糖基化位点对病毒增殖的影响将突变株W-6(试验组Ⅰ)、W-18(试验组Ⅱ)和感染性克隆株pIC-2DuCV(阳性对照组)与PBS(阴性对照组)分别对随机分为4组的3周龄雏鸭进行人工感染,在第7d、14d、21d、28d、35d、42d时采集胸腺、脾脏、法氏囊等组织进行荧光定量PCR和免疫组化检测并对结果进行分析。荧光定量PCR结果显示,与阳性对照组相比,试验组Ⅰ病毒DNA含量在被检组织中以肝脏含量相对较多,其拷贝数最高为104.9 copies/mg,在法氏囊中病毒DNA含量最低,其拷贝数最高为103.2copies/mg;而试验组Ⅱ与阳性对照组相比DNA含量相近,被检组织中DNA含量相对较多的组织为肝脏,其拷贝数分别最高为106.3 copies/mg (试验组11)和107.0 copies/mg(阳性对照组),而含量较低的组织则为法氏囊,其拷贝数最高值分别为104.2copies/mg (试验组11)和104.5 copies/mg(阳性对照组)。免疫组化结果显示,在被感染后,试验组Ⅰ各个组织中的阳性细胞平均光密度(Theaverage optical density, AOD)值中肝脏和法氏囊中阳性细胞的AOD值相对高一些,最高值在0.1774±0.00076到0.1679±0.01469之间；试验组Ⅱ中,阳性细胞AOD值最高的组织是肝脏和法氏囊,其最高值在0.2697±0.05571到0.2339±0.02187间,经差异性分析可知其AOD值与对照组相无明显差异。由此表明,DuCV Rep蛋白第6位氨基酸突变后可以使病毒在动物体内的增殖效率降低,而DuCV Rep蛋白第18位氨基酸突变后对病毒增殖则无明显影响,为DuCV的增殖进一步研究提供了理论依据。3. DuCV Rep蛋白N-糖基化位点对该病毒致病性的影响将突变株W-6(试验组Ⅰ)、W-18(试验组Ⅱ)和感染性克隆株pIC-2DuCV(阳性对照组)与PBS阴性对照组分别对3周龄雏鸭进行人工感染,在第7d、14d、21d、28d、35d、42d时采集胸腺、脾脏等组织进行病理学观察。结果显示：试验组Ⅰ、试验组Ⅱ与阳性对照组均出现胸腺出现散在出血点,肝脏有少量出血点,各组的组织病变均不明显。经HE染色可知各试验组与阳性对照组的主要免疫器官如胸腺、脾脏等均出现不同程度的病理损伤,主要表现为毛细血管充血；淋巴细胞间隙增宽；淋巴细胞发生核浓缩、核碎裂等现象。结果表明,DuCV Rep蛋白N-糖基化位点突变对其致病性无明显影响,这为DuCV的致病性的进一步研究提供了理论依据。