第一部分靶向相变型载HCPT液态氟碳脂质纳米造影剂FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid的制备及性能检测目的 制备一种叶酸修饰的靶向相变型载HCPT液态氟碳脂质纳米粒(FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid),检测其粒径电位、稳定性、相变特性、药物含量、药物释放及体内外靶向性等。方法 采用旋转蒸发-超声法制备靶向相变型载HCPT液态氟碳脂质纳米粒FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid,对其形态大小特征、粒径电位、铁含量进行检测。并于制备后不同时间点(0.5 h,1 h,2 h,6 h,12 h,24 h,36 h,48 h,60h,72 h,96 h)测量纳米粒粒径,光镜下观察不同温度下(40°C、45°C、50°C和55°C)纳米粒的相变情况,用高效液相色谱法检测FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid内的药物含量、体外药物释放及低强度聚焦超声LIFU促进药物释放。使用细胞实验和动物实验验证纳米粒FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid的靶向性能。结果 制备的FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid纳米乳呈棕褐色,光镜及荧光显微镜下纳米粒呈球形或点状,透射电镜显示细点状Fe3O4颗粒均匀分布在壳层内。Malvern激光粒径仪检测出FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid粒径321±67nm,Zeta电位为-50m V。原子吸收光谱法测得不同浓度的FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid纳米乳(5μg m L-1,10μg m L-1,20μg m L-1,40μg m L-1,80μg m L-1,160μg m L-1,320μg m L-1,640μg m L-1,1280μg m L-1和2560μg m L-1)中的Fe浓度分别为(0.43±0.08μg m L-1,0.71±0.09μg m L-1,1.63±0.31μg m L-1,3.52±1.21μg m L-1,7.60±1.35μg m L-1,15.05±3.16μg m L-1,29.12±4.05μg m L-1,53.32±5.25μg m L-1,117.65±6.36μg m L-1和236.37±11.97μg m L-1)。在4°C条件下,纳米粒粒径在48小时内无明显增大,48小时后粒径缓慢增大。40°C时纳米粒基本保持稳定,45°C时部分纳米粒发生液气相变,体积增大,50°C时相变纳米粒数量明显增多,体积增大明显,55°C时仅存少量相变纳米粒。FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid乳液药物包封率为60.51%±2.33%,载药量为8.33%±0.57%。体外药物释放试验显示,FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid乳液内的药物HCPT呈缓慢释放,24小时释放约25%,48小时释放约60%,60小时后药物释放趋平缓。随着LIFU强度的增加,药物释放量亦随着增加。结论 本实验成功的制备了造影剂FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid,形态规则,大小较均匀,性质稳定,具有较好的液气相变的能力,能够在LIFU作用下释放药物。第二部分FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid造影剂增强超声、光声及磁共振显像研究目的 观察FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid造影剂体外增强超声、光声和磁共振显像的效果,研究其作为多模态造影剂的可行性;体内实验了解FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid造影剂增强超声、光声和磁共振显像的能力。方法 本部分实验分为三节分别进行。在第一节中首先使用加热的方法,了解在不同温度条件下纳米乳增强超声显影的效果,并于显微镜下观察加热后纳米粒相变情况。体外及体内声致相变实验中,LFIU仪使用不同声强度(0.8W/cm2、1.6W/cm2、2.4 W/cm2、3.2 W/cm2)及不同时间(1min、2min、3min、4min),观察LIFU辐照后纳米乳于体外及体内增强超声显影的效果,了解导致纳米粒相变的最佳LIFU辐照强度及时间。在第二节里,将Fe3O4溶液、FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid乳液及FA/PFP/HCPT@Lipid乳液分别行光声显影实验,了解Fe3O4增强光声信号的效果。并用不同浓度FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid行光声显影,了解光声信号强度的变化。在细胞光声实验中,SKOV3细胞与FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid纳米粒孵育不同时间后观察细胞光声信号强度。体内光声实验中,经裸鼠尾静脉分别注射FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid乳液、Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid乳液和不含Fe3O4的造影剂FA/PFP/HCPT@Lipid乳液,于注射之后0.5 h、1 h、6h分别行光声显像。在第三节里,将FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid纳米乳配置成不同的浓度,观察磁共振显影的差异。体内磁共振实验中,经裸鼠尾静脉分别注射FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid乳液、Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid乳液和不含Fe3O4的造影剂FA/PFP/HCPT@Lipid乳液,于注射之后0.5 h、1 h、6 h分别行磁共振显像。结果 在第一节中,谐波超声模式下,水浴锅温度为40°C时,水囊内无增强。45°C和50°C时,水囊内显影明显增强。至55°C时,水囊内回声增强又相对减弱。于45°C和50°C水囊吸出的乳液在光镜下可见到较多气泡产生。体外LIFU声致相变实验结果显示,2.4W/cm2、2分钟有最佳的声致相变效果,此时显微镜下相变气泡较多。体内相变实验结果显示,3.2W/cm2、2分钟的LIFU条件具有最佳的体内相变效果。在第二节里,Fe3O4和FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid乳液显示较强的光声信号,而FA/PFP/HCPT@Lipid乳液几乎不显示光声增强信号。FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid的光声信号随着Fe3O4浓度的升高而逐渐增强。细胞光声实验中,随着纳米粒与SKOV3细胞孵育时间的延长,光声信号明显增加。体内光声实验中,注射FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid乳液的裸鼠其肿瘤于注射后1小时显示明显光声信号,肿瘤局部光声信号强度值明显高于另外两组(P<0.05)。在第三节的体外实验中,FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid呈现磁共振负性显影,且随着装载的Fe3O4浓度的增加,MR信号强度逐渐下降。体内磁共振实验中,注射FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid的裸鼠其肿瘤于注射后1小时显示明显磁共振负性显影信号,肿瘤局部磁共振信号强度值明显低于另外两组(P<0.05)。结论 FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid造影剂能够于体内外增强超声、光声和磁共振显像,具备成为多模态造影剂的潜能。第三部分FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid造影剂靶向治疗卵巢癌实验研究目的 了解FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid造影剂及药物HCPT在裸鼠体内的分布情况,以及FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid造影剂对SKOV3卵巢癌的靶向治疗效果。方法 造影剂及药物体内分布实验:将30只荷瘤裸鼠随机分为两组,分别经尾静脉注射携荧光Di I的造影剂FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid乳液和Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid乳液,于注射后0.5h,1h,6h,12h,24h脱颈处死裸鼠,瘤块行超薄切片,显微镜下观察切片内造影剂分布情况。取50只荷瘤裸鼠随机分为两组,分别经尾静脉注射HCPT注射液和FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid纳米乳,于注射后0.5h,1h,6h,12h,24h眼球取血处死裸鼠,检测血清内药物浓度分布,同时取裸鼠重要脏器及肿瘤组织匀浆后行高效液相色谱法检测各组织内药物浓度。另外检测LIFU作用后肿瘤局部药物浓度分布。靶向治疗实验:将30只裸鼠随机分为6组,分别给予不同的处理:FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid+LIFU组;FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid注射液组;HCPT组;FA/Fe3O4/PFP@Lipid+LIFU组;Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid注射组;生理盐水组。治疗后测量肿瘤大小,计算肿瘤生长曲线及抑瘤率。行免疫组织化学检测肿瘤细胞的增殖和凋亡。结果 造影剂及药物体内分布实验:靶向组肿瘤超薄切片各时间点均可见荧光,1小时荧光最明显。而非靶向组未见荧光显示。在每一个检测时间点,FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid纳米乳组裸鼠的血药浓度均高于HCPT注射液组。FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid注射液组的肿瘤组织药物浓度显著高于HCPT注射组(P<0.05),而FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid+LIFU组的肿瘤组织药物浓度显著高于FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid纳米乳注射液组(P<0.05)。靶向治疗实验:FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid+LIFU组裸鼠肿瘤生长指数最低,抑瘤率最高。免疫组化结果显示,FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid+LIFU组的增殖指数最低(p<0.05),凋亡指数最高(p<0.05)。结论 纳米粒FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid可以延缓药物HCPT在体内的存留时间,靶向结合于肿瘤细胞的纳米粒,在低强度聚焦超声LIFU的作用下,对裸鼠卵巢癌有良好的治疗效果,有望对肿瘤的治疗开辟新的途径。