哺乳动物胚胎的冷冻保存对胚胎生物学和胚胎毒性学的发展,尤其对生物资源保护以及人类辅助生殖等的研究具有重要的作用。本试验目的在于选用合适的冷冻保护剂对小鼠2-细胞和4-细胞期胚胎进行冷冻保存,并对解冻后胚胎的细胞形态特征,体外发育情况和损伤机理进行研究。另外,通过优化冷冻方法和胚胎培养条件建立一种适宜小鼠2-细胞及4-细胞胚胎冷冻保存程序及解冻后体外发育体系。为正在进行的空间小鼠胚胎生物学研究提供充足的实验材料,同时也为冷冻生物学基础研究提供一些理论依据和参考。为了筛选小鼠2–细胞胚胎适合的冷冻保护剂,比较了1,2-丙二醇(1, 2-propanediol,PROH)、甘油(glycerol,GLY)、乙二醇(ethylene glycol, ETG)和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)4种冷冻保护剂对小鼠2-细胞胚胎的渗透性和毒性。结果显示1.5 mol/L的1,2-丙二醇、乙二醇和二甲基亚砜冷冻保护剂对2-细胞胚胎的渗透性显著高于甘油保护剂;1.5 mol/L的乙二醇、1,2-丙二醇和甘油保护剂对胚胎的毒性显著地低于二甲基亚砜,综合渗透性和毒性结果得出乙二醇和1,2-丙二醇适合于小鼠2-细胞胚胎冷冻保存。采用两步平衡快速冷冻法对胚胎进行冷冻保存,进一步比较PROH和ETG对2-细胞期小鼠胚胎冷冻的冷冻效果及体外发育情况。结果表明:采用PROH进行胚胎冷冻,解冻后胚胎4-细胞发育率和囊胚发育率极显著地高于ETG组(分别为82.7% vs. 64.6%; 61.2% vs. 29.1%, P<0.01);囊胚移植结果表明冷冻胚能够产生正常的后代,但PROH组和ETG组妊娠产仔率无统计学差异(32.4% vs. 32.2%和26.9% vs. 23.5%, P>0.05)。另外,通过对冷冻试验组胚胎进行细胞骨架微丝的检测,结果表明ETG组2-细胞胚胎细胞骨架损伤比例显著地高于PROH组是其体外发育存在差异的主要原因。结论为PROH对2-细胞期小鼠胚胎冷冻的冷冻效果要显著地优于ETG。胚胎冷冻和解冻不可避免的会对细胞造成一定的损伤。为了进一步分析2-细胞胚胎冷冻损伤的机理,探讨引起胚胎解冻后发育停滞的原因,本试验从细胞膜完整性,细胞骨架结构改变,细胞内线粒体分布和代谢以及细胞凋亡这几个方面的检测来探讨胚胎冻存后发育阻滞的机理。结果表明即使细胞膜和细胞骨架都完整的胚胎仍然会发生发育阻滞,而造成此类胚胎发育阻滞的主要原因是由于细胞内线粒体受到破坏,细胞的代谢功能和细胞呼吸功能受阻,从而诱导细胞发生凋亡。冷冻损伤还可能会影响胚胎自分泌一些激素和因子的能力,进而影响胚胎的体外发育,因此优化冷冻胚胎体外培养的条件,提高胚胎体外发育的研究变得非常重要。本研究利用快速冷冻法对小鼠4-细胞胚胎进行冷冻保存,解冻后在胚胎培养液中添加10 ng/mL的表皮生长因子(EGF),通过三组平行对照比较来评价胚胎体外的发育情况。结果显示:解冻后的胚胎在添加EGF后囊胚发育率及孵化率(分别为:82.4%和61.3%)要极显著地高于(P<0.01)不添加EGF组冷冻胚胎(分别为:68.9%和40.3%),与新鲜对照组比较差异不显著;添加EGF组囊胚的细胞总数(64.2±6.5)显著地要高于不添加EGF组囊胚细胞总数(52.3±11.6)(P<0.05)。另外,研究发现EGF发挥的作用主要是通过与细胞膜上EGFR结合共同发挥的,EGFR表达在8-细胞时期才开始出现。本研究结果表明胚胎解冻后在培养基中添加10 ng/mL的EGF可以显著改善其体外发育的能力。综上所述,在小鼠2-细胞胚胎研究中,筛选出1,2-丙二醇是小鼠2-细胞胚胎最佳的冷冻保护剂,解冻后2-细胞胚胎冷冻损伤主要是由于胚胎的线粒体受损从而诱导细胞发生凋亡,造成胚胎发生阻滞。4-细胞胚胎冷冻保存研究中,在胚胎培养基中添加10 ng/mL的EGF能够显著地提高冷冻胚胎体外培养的囊胚发育率、孵化率,而这种作用是从8-细胞/早期桑椹胚时期才开始发挥的。